上海交通大學附屬上海市胸科醫院病理科

張杰肺癌個體化檢測及質量控制本文檔共74頁；當前第1頁；編輯于星期三\16點43分9345例手術切除肺癌標本分析

Female2761casesmale6584cases29.5%70.5%1:

2.38

本文檔共74頁；當前第2頁；編輯于星期三\16點43分2004WHOLungCancerClassification

腺癌大細胞癌鱗癌腺鱗癌其它本文檔共74頁；當前第3頁；編輯于星期三\16點43分腺癌8140/3腺癌，混合性亞型8255/3腺泡性腺癌8550/3乳頭狀腺癌8260/3細支氣管肺泡癌8250/3非黏液性8252/3黏液性8253/3非黏液和黏液混合性8254/3實性腺癌伴有黏液產物8230/3胎兒性腺癌8333/3黏液性（“膠樣”）癌8480/3黏液性囊腺癌8470/3印戒細胞腺癌8490/3透明細胞腺癌8310/3

肺癌的WHO組織學分類（2004年）本文檔共74頁；當前第4頁；編輯于星期三\16點43分

浸潤前病變非典型腺瘤性增生

原位腺癌（≤3cm原來的BAC）非黏液性黏液性黏液/非黏液混合性微浸潤性腺癌（≤3cm貼壁狀為主的腫瘤，浸潤灶≤5mm）非黏液性黏液性黏液/非黏液混合性浸潤性腺癌

貼壁狀為主（原來的非黏液性BAC生長方式，浸潤灶＞5mm）

腺泡性為主乳頭狀為主微乳頭狀為主

實性為主伴有黏液產物

浸潤性腺癌變型:

浸潤性黏液腺癌（原來的黏液性BAC）膠樣型胎兒型（低度和高度惡性）腸型肺腺癌的IASLC/ATS/ERS分（2011年）本文檔共74頁；當前第5頁；編輯于星期三\16點43分小活檢和/或細胞學標本難以進一步分型，通常診斷為非特指性NSCLC（NSCLC-NOS）提出借助于免疫組織化學（TTF-1、p63(p40)等）盡可能將NSCLC區分為傾向腺癌和傾向鱗狀細胞癌，以提供藥物治療的選擇肺腺癌對多靶點抗葉酸藥物培美曲賽（pemetrexed）和抗血管內皮生成藥物貝伐單抗（bevacizumab）治療有效，而鱗狀細胞癌對培美曲賽治療效果不如腺癌，用貝伐單抗治療可引起威脅生命的大出血小活檢和細胞學診斷肺癌本文檔共74頁；當前第6頁；編輯于星期三\16點43分TTF-1

鱗癌?腺癌?本文檔共74頁；當前第7頁；編輯于星期三\16點43分

鱗癌?腺癌?P63(p40)

本文檔共74頁；當前第8頁；編輯于星期三\16點43分小活檢和細胞學標本除用于病理診斷外，要適當留存一些標本做分子檢測（基因突變、擴增和染色體易位等）新分類還推薦如有可能，細胞學檢查最好與小活檢細胞學檢測一起進行，以提高診斷準確性細胞學是一個有用的診斷方法，尤其是和組織學相結合時從細胞穿刺或胸腹水標本中保存細胞包埋塊（cellblock)，用于分子檢測小活檢和細胞學診斷肺癌本文檔共74頁；當前第9頁；編輯于星期三\16點43分2011年NCCN非小細胞肺癌治療指南（中文版）本文檔共74頁；當前第10頁；編輯于星期三\16點43分

2012

NCCN指南推薦所有NSCLC患者進行檢測

中國版NCCN指南與美國版NCCN指南的區別：除了腺癌、大細胞癌和未分類的NSCLC患者，中國版NCCN指南要求鱗癌也要進行EGFR突變檢測本文檔共74頁；當前第11頁；編輯于星期三\16點43分2013

NCCN指南推薦更新，EGFR檢測更為重要2013NCCN指南與既往不同在于：未知人群減少，腺癌/大細胞癌患者均需要做檢測為I類證據/不吸煙鱗癌也可以EGFR突變檢測本文檔共74頁；當前第12頁；編輯于星期三\16點43分衛生部原發性肺癌診療規范（2011）本文檔共74頁；當前第13頁；編輯于星期三\16點43分NatureReview2007,7:169非小細胞肺癌中藥敏相關的EGFR突變本文檔共74頁；當前第14頁；編輯于星期三\16點43分外顯子19，21突變為常見EGFR敏感突變類型DacicS.AdvAnatPathol2008;15:241-247.RielyGJ,etal.ClinCancerRes2006;12(24):7232-7241.MurrayS,etal.JThoracOncol2008;3:832-839.對EGFR-TKI的反應外顯子突變分布頻率敏感18G719X4%19缺失50%21L858RL861X40%耐藥20T790MD770_N771insNPG6%本文檔共74頁；當前第15頁；編輯于星期三\16點43分肺癌與EGFR

目前國內開展EGFR檢測的單位逐漸增多有關中國人EGFR基因突變研究的報道增多2011年中華病理學雜志發表了“關于EGFR突變檢測共識”2011年11月15日1成立衛生部分子病理質控中心本文檔共74頁；當前第16頁；編輯于星期三\16點43分項目孫孟紅王芳馮勤王立帥趙靜范苗靜張杰合計技術測序TagManPCR優化PCRARMS測序測序測序總數目29914103092651922824543211突變率42.2%28.4%34%30.2%33.3%42.6%48.2%37%吸煙與突變非吸煙／37.6%40.2%41%50%54.3%52.7%46%吸煙／14.4%22.2%15.2%9%32.9%41.1%22.5%性別男33.7%19.8%30.4%22.6%20.9%36%39.5%29%女53.5%43.2%39.2%39.7%51.9%51.3%59.6%48.3%(中華病理學雜志2011年10期）本文檔共74頁；當前第17頁；編輯于星期三\16點43分項目孫孟紅王芳馮勤王立帥趙靜范苗靜張杰合計外顯子分布182%／5.7%／／4.1%3.9%1948.7%48.1%39%40%60.9%48.4%53.9%48.4%206.7%／／6%／6.43%6.4%2142.5%51.8%55.2%54%39.1%51.6%44.3%48.2%組織分型腺癌46.5%33.5%38.8%37.8%37.9%47.8%56.8%42.7%BAC／61.3%／58.5%73%47.1%普通／32.4%／37.9%／／鱗癌13.3%／22.2%／7.5%23.6%10.3%15.4%腺鱗癌7／13／4／8／2／67／910／18大細胞癌／／3／14／1／5／10／31其他／／／／5／／(中華病理學雜志2011年10期）本文檔共74頁；當前第18頁；編輯于星期三\16點43分EML4-ALK檢測：方法概述本文檔共74頁；當前第19頁；編輯于星期三\16點43分熒光原位雜交

(FISH)本文檔共74頁；當前第20頁；編輯于星期三\16點43分逆轉錄-聚合酶鏈反應

(RT-PCR)本文檔共74頁；當前第21頁；編輯于星期三\16點43分Ⅰ期臨床結果再回顧本文檔共74頁；當前第22頁；編輯于星期三\16點43分三種檢測方法比較本文檔共74頁；當前第23頁；編輯于星期三\16點43分FISH、IHC和RT-PCR比較參數表FISHIHCRT-PCR靈敏度分離信號細微使用檢測增強裝置后靈敏度可提高高檢測到未知的變異體是是否可否區分融合類型否否是工作強度大是否否要求非常專業的培訓是否否結果判讀人為主觀影響大大小同時細胞形態可視化否是否在專業機構外廣泛使用否是否AdaptedfromMitsudomi,IASLC2011;Abs#MTE22.1Hirsch,IASLC2011;Abs#O05.08本文檔共74頁；當前第24頁；編輯于星期三\16點43分ROS1基因與NSCLCROS1基因位于6號染色體長臂22（6q22）共有43外顯子其mRNA全長7638bp本文檔共74頁；當前第25頁；編輯于星期三\16點43分ROS受體酪氨酸激酶的靶向治療原理FN-III

likerepeatsTK

domainROS在腦、肺、胃、乳腺和肝腫瘤/細胞系中的過表達在結腸癌和腎癌細胞系中ROS突變腫瘤中發現的ROS

融合FIG-ROS：惡性膠質瘤細胞系SCL34A2-ROS:非小細胞肺癌細胞系CD74-ROS:非小細胞肺癌患者克唑替尼可抑制ROS

融合基因細胞系的

生長StructureofROSEl-Deebetal.,MedResRev.2010epub本文檔共74頁；當前第26頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第27頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第28頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第29頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第30頁；編輯于星期三\16點43分克唑替尼:概述名稱:PF-02341066通用名:克唑替尼商品名:XALKORITM化學式:C21H22Cl2FN5O作用機制:競爭性ATP抑制劑主要靶點:ALK、c-Met、ROS2011年8月26日美國FDA批準用于ALK陽性非小細胞肺癌克唑替尼在ALKATP結合部位Pfizer,dataonfile本文檔共74頁；當前第31頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第32頁；編輯于星期三\16點43分ROS1基因重排ROS1的重排成為了一種繼成功發現肺癌突變基因KRAS（占25%）、EGFR（占10-15%）、ALK（占4%）后，再一次發現最新的肺癌基因突變ROS1。ROS1基因突變的癌癥患者常見于年齡偏小，不吸煙，病理類型為腺癌的肺癌。由ROS1基因重新排列引起的癌癥在非小細胞肺癌中占1%。ROS1重排可引起癌基因ROS1融合激酶的表達及對ROS激酶抑制劑敏感性。Crizotinib作為C-MET、ALK及ROS的小分子酪氨酸激酶抑制劑可能成為進展期非小細胞肺癌有效治療藥物。該藥物已經獲準用于局部進展期和轉移性ALK陽性的非小細胞肺癌患者的治療。本文檔共74頁；當前第33頁；編輯于星期三\16點43分分子靶向基因檢測質量問題實驗室：達標人員資質標準化檢測人員上崗培訓、上崗證書報告簽發人員資質、分子病理醫師實驗條件；檢測方法：方法越是靈敏，抗污染的問題越是突出

標本來源：不同的標本，應相對采用不同的檢測方法本文檔共74頁；當前第34頁；編輯于星期三\16點43分分子病理實驗室質量要求

二.PCR實驗室要達標，通過國家驗證

檢測結果要做室間比對

國際間的室間比對(

EMQN,ESP,ETOPandESMO)分子病理實驗室要通過ISO15189認可本文檔共74頁；當前第35頁；編輯于星期三\16點43分臨床標本與研究標本的差異標本類型腫瘤細胞含量標本處理其他分析前、分析后處理實際臨床標本新鮮組織、蠟塊、穿刺組織、脫落細胞等隨意性大，無嚴格要求固定方式、試劑、標本離體時間各異不定研究標本統一要求要求統一，被病理所確認統一的保存以及運送條件盡量統一本文檔共74頁；當前第36頁；編輯于星期三\16點43分分子檢測與靶向治療的關鍵步驟根據結果制定

治療方案臨床采集合適的

組織標本選擇合適的檢測方法123本文檔共74頁；當前第37頁；編輯于星期三\16點43分分子檢測與靶向治療的關鍵步驟根據結果制定

治療方案臨床采集合適的

組織標本選擇合適的檢測方法123本文檔共74頁；當前第38頁；編輯于星期三\16點43分標本來源

手術切除標本氣管鏡活檢標本經皮穿刺標本淋巴結穿刺標本胸水/心包細胞學標本血清DNA標本及循環細胞標本相關問題標本異質性標本類型標本的收集和儲存標本是獲得高質量檢測結果的重要前提本文檔共74頁；當前第39頁；編輯于星期三\16點43分常用標本獲取方法CT引導下肺穿刺活檢模擬氣管鏡引導下經支氣管鏡肺組織活檢(VB-TBLB)經氣管鏡超聲引導下活檢(EBUS)鎖骨上淋巴結穿刺活檢胸腔閉式引流術心包穿刺術外科開胸手術活檢胸腔鏡活檢縱隔鏡活檢微創手術活檢本文檔共74頁；當前第40頁；編輯于星期三\16點43分取樣中存在的問題腫瘤的位置腫瘤生長的部位有時難以進行內科穿刺活檢，需要依靠外科手術活檢取材細針穿刺時使用的器材尺寸可能影響細胞的獲取量及DNA的質量由于無法保證每次都能取得足夠的標本，需要一些適用于小標本的檢測方法本文檔共74頁；當前第41頁；編輯于星期三\16點43分腫瘤標本獲取的主要途徑手術(切除/切取)支氣管鏡(活檢：中央型)穿刺(活檢：周圍型)制備蠟塊切片HE染色確認癌細胞以臨床醫生認為最容易獲取的方式原發病灶/轉移灶腫瘤組織胸水等標本的獲取本文檔共74頁；當前第42頁；編輯于星期三\16點43分標本的獲?。阂源┐虨槔尚行栽u估根據病灶位置選擇合適的穿刺手段復雜情況的處理

嚴重水腫基底部位呼吸動度較大部位的腫塊腫塊內部支氣管充氣征明顯腫瘤內血管豐富

基底部位呼吸動度較大部位的腫塊腫瘤內血管豐富嚴重水腫腫塊內部支氣管充氣征明顯本文檔共74頁；當前第43頁；編輯于星期三\16點43分標本的獲取對周圍型病變，TBLB創傷小，可重復性強，是一種相對安全有效的檢查方法，但TBLB取材大小受器械規格限制，活檢組織易受擠壓變形而影響檢測結果1鎖骨上淋巴結穿刺活檢是一種便捷有效的臨床技術，檢出率高，副反應小2，但僅能提供細胞學樣本。EBUS可通過中央氣道取的組織，診斷迅速，并發癥少，是一種安全性較好的活檢方法。對肺癌和其他縱膈惡性疾病診斷價值高，并可協助分期3胸腔閉式引流術和心包穿刺術并發癥少，容易為患者接受，術前需行超聲定位，可在超聲引導或CT引導下進行4,5。但引流獲得標本需進一步富集。外科方法可獲取大量、新鮮樣本，但創傷較大或費用昂貴本文檔共74頁；當前第44頁；編輯于星期三\16點43分經支氣管肺活檢腫瘤

<正常細胞的5%CT引導穿刺肺癌的活檢標本通常僅含有少量腫瘤細胞本文檔共74頁；當前第45頁；編輯于星期三\16點43分適宜的切片：HE片確認*，癌細胞數≥200個(不推薦依經驗盲取)常規切片(4~5μm厚，普通載玻片)連續切片8~10張刀片：一次性(不推薦交叉使用)標本處理

：離體后處理：及時切開、固定(盡快)固定液：10%中性福爾馬林(pH≈7.0)(不推薦使用任何其它溶液)固定液量：≥10倍體積固定時間：6~48小時如何獲取優質標本：標本處理本文檔共74頁；當前第46頁；編輯于星期三\16點43分如何獲取優質的標本：標本類型石蠟組織：盡可能送檢一年內的石蠟標本石蠟切片：含腫瘤細胞越多越好(50%以上)；組織部位面積約6mmx6mm以上包埋組織：組織塊不小于0.5×0.5×0.5(cm)新鮮組織：比石蠟等處理過的舊組織，DNA保存得更完整，對PCR實驗更有利，但一定要經病理學確認含有腫瘤組織50%以上；重量≥10ｍg(約米粒大小以上)，經PBS或生理鹽水沖洗干凈取癌組織的中心位置組織塊(避開壞死區域)，固定于10%中性福爾馬林溶液中，盡快送病理科要有病理學診斷只要能獲得足夠的癌細胞，各種取材方式均可對于復發的患者，再次活檢不僅可確診，還可以獲得分子標志物的信息本文檔共74頁；當前第47頁；編輯于星期三\16點43分如何獲取優質的標本：標本類型盡可能取得大標本進行檢測臨床常用的取樣方法取得標本量通常較少內鏡活檢、穿刺活檢、細胞學標本(支氣管刷檢,細針穿刺)小標本檢測失敗率53–66%(內鏡活檢與穿刺活檢)，而切除活檢標本的失敗率僅24%標本中腫瘤細胞的含量也十分重要組織標本富集細胞學標本富集直接測序要求使用腫瘤細胞含量較高(50–70%)的標本EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.本文檔共74頁；當前第48頁；編輯于星期三\16點43分分子水平的肺癌細胞存在異質性

腫瘤內異質性

原發部位與轉移部位的異質性如何獲取優質的標本：標本異質性EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.腫瘤異質性可能影響研究結果如果可行，至少取得3個代表性部位的標本進行檢測本文檔共74頁；當前第49頁；編輯于星期三\16點43分如何獲取優質的標本：標本的采集和儲存經福爾馬林固定處理的標本可能存在以下問題

核酸分解片段長度縮短干擾PCR結果固定標本中可能存在序列改變EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.盡量采用新鮮冰凍組織采用標準濃度的固定液(10%中性福爾馬林緩沖液

，8–24小時)記錄固定液標本以原始大小保存，而不是切片保存如果是切片標本，應記錄切片時間

本文檔共74頁；當前第50頁；編輯于星期三\16點43分如何獲取優質的標本：標本含量一些突變患者可能沒有被檢測到(假陰性)取決于檢測方法的敏感度為保證DNA測序的敏感性，要求檢測標本中腫瘤細胞≥50%本文檔共74頁；當前第51頁；編輯于星期三\16點43分分子檢測與靶向治療的關鍵步驟根據結果制定

治療方案臨床采集合適的

組織標本選擇合適的檢測方法123本文檔共74頁；當前第52頁；編輯于星期三\16點43分基因突變檢測影響因素---方法學因素ME-PCR/SequencingO=產物轉移/加入試劑/開管操作qPCR:

Real-time

DetectionPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRHetero-

duplexCapillaryElectro-phoresisARMS&PNA-LNAclampPCR/SequencingNestedPCR/SequencingPCR/

HRMA/

dHPLCPCR/

RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingRFLPOOOOOOOOOOOOTaqMan

Clean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizingOConfirmationbysequencingPCR/

SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencingRxnPyroSequencingOO123456Steps7ConfirmationbysequencingOConfirmationbysequencingOOO1%~10%3-10%10%3-12%20~30%20~30%<1%qPCR:

Real-time

Detection~10%本文檔共74頁；當前第53頁；編輯于星期三\16點43分直接測序法本文檔共74頁；當前第54頁；編輯于星期三\16點43分熒光定量PCR本文檔共74頁；當前第55頁；編輯于星期三\16點43分石蠟切片顯微切割Scorpions-ARMSIPASS本文檔共74頁；當前第56頁；編輯于星期三\16點43分ARMSvs.DNA測序中華病理學雜志2008;37(5):294-9.結果檢出率成功率共計可分析不可分析突變無突變ScorpionsARMS**4240051.2%100%82例直接測序***25332430.5%70.7%82例*肺癌手術石蠟切片標本檢測EGFR基因突變**IPASS方法學

***INTEREST方法學本文檔共74頁；當前第57頁；編輯于星期三\16點43分ARMSvs.DNA測序測序法ARMS敏感度25%1%石蠟組織標本成功率低高商用試劑盒無有流程與速度復雜/慢簡單/快數據分析要求高低試劑成本相對低相對高儀器成本高低1.DacicS.AdvAnatPathol2008;15(4):241-247.2.中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家組.中華病理學雜志2011;40(10):700-702.本文檔共74頁；當前第58頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第59頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第60頁；編輯于星期三\16點43分本文檔共74頁；當前第61頁；編輯于星期三\16點43分EGFR基因突變檢測方法的選擇DNA測序在部分地區仍然是EGFR檢測的金標準其他方法，比如ARMS可能比直接測序更敏感，目前已被廣泛應用新的EGFR基因檢測方法層出不窮，其檢驗效能有待進一步考證優化檢測途徑，最大限度提高檢測敏感性、降低假陽性和假陰性率以獲得可靠的檢測結果對每個患者來說都至關重要本文檔共74頁；當前第62頁；編輯于星期三\16點43分

關于EGFR突變檢測共識（中華病理學雜志2011年10期）關于EGFR檢測時間活檢：1小時內送病理科及時固定于4%中性甲醛中小標本6-12h大標本6-48h病理報告3個工作日（包括免疫組化）EGFR5-7個工作日總共10個工作日，完成全部診斷和檢測工作本文檔共74頁；當前第63頁；編輯于星期三\16點43分

關于EGFR突變檢測共識DNA提?。?/p>

PCR擴增成敗最關鍵步驟

建議采用正規公司的DNA提取試劑盒

DNA提取質量比數量更為重要建議對提取DNA模板做質量檢測OD值DNA標本質量不符質量，陽性則罷陰性要注明。組織切片中要有200-400個細胞5-10um切片

10張本文檔共74頁；當前第64頁；編輯于星期三\16點43分EGFR突變檢