特殊生物顯微鏡的原理與使用本文檔共90頁；當前第1頁；編輯于星期二\11點26分主要內容暗視野顯微鏡相差顯微鏡偏光顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡本文檔共90頁；當前第2頁；編輯于星期二\11點26分1暗視野顯微鏡根據丁達爾效應原理設計的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡觀察到明場看不到的極其微小的物體最高分辨率可達0.004微米本文檔共90頁；當前第3頁；編輯于星期二\11點26分1.1原理丁達爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內飛揚的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒?？梢娏?，這就是微粒發(fā)光。暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設計的。1.2結構特點使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內，因而整個視野是黑暗的。本文檔共90頁；當前第4頁；編輯于星期二\11點26分暗場顯微鏡原理本文檔共90頁；當前第5頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第6頁；編輯于星期二\11點26分1.3成像特點及優(yōu)缺點在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細微結構。但被檢物體為非均質時，并大于1／2波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結構，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。本文檔共90頁；當前第7頁；編輯于星期二\11點26分1.4應用：微小粒子、細菌形態(tài)、細菌記數(shù)，透明標本觀察等。1.5暗場顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求本文檔共90頁；當前第8頁；編輯于星期二\11點26分1.6暗場觀察方式調節(jié)(1)換上暗場聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場光闌適當縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時在視場中看到視場光圈的輪廓象。上下緩慢調整聚光鏡，使視場光圈像清晰可見。(3)視場光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側兩個調節(jié)螺絲進行調整，再將其開大到相應位置。本文檔共90頁；當前第9頁；編輯于星期二\11點26分2相差顯微鏡2.1原理光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不同。當光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本的道理。而活細胞和未經染色的生物標本，因細胞各部微細結構的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。本文檔共90頁；當前第10頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第11頁；編輯于星期二\11點26分相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。2.2結構特點相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸調節(jié)用的望遠鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。本文檔共90頁；當前第12頁；編輯于星期二\11點26分相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調軸望遠鏡是用來進行合鈾調節(jié)的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合（共軛重合），才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。本文檔共90頁；當前第13頁；編輯于星期二\11點26分2.3使用方法（1）相差裝置的調換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調焦打開光源，旋轉集光器轉盤，將“0”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調焦。旋轉環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應，如相差物鏡為40X時應用40X標示孔的光闌。本文檔共90頁；當前第14頁；編輯于星期二\11點26分（3）合鈾調整拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉動望遠鏡內筒使其上升，當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。（4）觀察換回目鏡，按常規(guī)要領進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。本文檔共90頁；當前第15頁；編輯于星期二\11點26分2.4用途用于觀察組織培養(yǎng)中活細胞形態(tài)結構?；罴毎麩o色透明，一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結構，組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡。本文檔共90頁；當前第16頁；編輯于星期二\11點26分偏光顯微鏡依據波動光學原理觀察和精密測定標本細節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質結構的一種顯微鏡分辨率可達0.04微米將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢,以鑒別某一物質具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)本文檔共90頁；當前第17頁；編輯于星期二\11點26分一、偏振光與自然光1.橫波的偏振性光矢量的振動方向總與光的傳播方向垂直，在垂直于光傳播方向的平面內,可有不同的振動方向。v0HE只有橫波才有偏振現(xiàn)象本文檔共90頁；當前第18頁；編輯于星期二\11點26分2.線偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振動。E播傳方向振動面3.自然光—普通光源發(fā)出的光,在垂直于傳播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E的振幅都相等。本文檔共90頁；當前第19頁；編輯于星期二\11點26分二、起偏和檢偏起偏：使自然光（或非線偏振光）變成線偏振光的過程。檢偏：檢查入射光的偏振性的過程。雙折射現(xiàn)象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光的現(xiàn)象。尼科耳棱鏡。在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細胞的化學研究。本文檔共90頁；當前第20頁；編輯于星期二\11點26分尋常光線(o光):遵守折射定律。對于晶體一切方向都具有相同的折射率，且在入射面內傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。它的折射率隨方向而變化，并且不一定在入射面內傳播。o光和e光都是線偏振光,且振動方向相互垂直本文檔共90頁；當前第21頁；編輯于星期二\11點26分二向色性：某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）對光振動有強烈的選擇性吸收能力，這種性質稱為二向色性。如電氣石晶體對自然光的某一振動方向上的光振動幾乎完全吸收，而垂直于該方向的光振動只稍微減弱后通過。旋光現(xiàn)象：線偏振光通過某些透明介質后，它的光振動方向將繞著光的傳播方向旋轉某一角度的現(xiàn)象，稱為旋光現(xiàn)象。這種介質稱為旋光物質。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。本文檔共90頁；當前第22頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第23頁；編輯于星期二\11點26分偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....本文檔共90頁；當前第24頁；編輯于星期二\11點26分偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....本文檔共90頁；當前第25頁；編輯于星期二\11點26分偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....本文檔共90頁；當前第26頁；編輯于星期二\11點26分偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....本文檔共90頁；當前第27頁；編輯于星期二\11點26分尼科爾棱鏡本文檔共90頁；當前第28頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第29頁；編輯于星期二\11點26分用途用于研究組織晶體物質及纖維等的光學性質本文檔共90頁；當前第30頁；編輯于星期二\11點26分微分干涉顯微鏡無色透明活體標本的細微結構圖象呈浮雕狀的立體感觀察效果更加逼真本文檔共90頁；當前第31頁；編輯于星期二\11點26分1原理通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強度相等的光束，光束載極近的兩點（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。2特點可以使被檢物體產生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調節(jié)背景和物體的顏色變化而達到理想的效果。本文檔共90頁；當前第32頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第33頁；編輯于星期二\11點26分熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光365nm或紫藍光420nm)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。本文檔共90頁；當前第34頁；編輯于星期二\11點26分

什么是熒光：物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光本文檔共90頁；當前第35頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第36頁；編輯于星期二\11點26分熒光的種類：自發(fā)熒光（固有熒光）二次熒光本文檔共90頁；當前第37頁；編輯于星期二\11點26分熒光的性質：

吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率本文檔共90頁；當前第38頁；編輯于星期二\11點26分二、熒光顯微鏡的種類：透射式落射式本文檔共90頁；當前第39頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第40頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第41頁；編輯于星期二\11點26分熒光顯微鏡本文檔共90頁；當前第42頁；編輯于星期二\11點26分三、熒光顯微鏡主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡物鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡本文檔共90頁；當前第43頁；編輯于星期二\11點26分熒光顯微鏡內部構造本文檔共90頁；當前第44頁；編輯于星期二\11點26分落射熒光顯微鏡光路圖本文檔共90頁；當前第45頁；編輯于星期二\11點26分透射熒光顯微鏡光路圖本文檔共90頁；當前第46頁；編輯于星期二\11點26分落射式熒光顯微鏡優(yōu)點由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調節(jié)。采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場光闌的效果。物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大被率時，也可以獲得高分辨率的像。厚的或不透明的標本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。其它觀察法也能與反射熒光結合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結合?？梢员苊獠槐匾臒晒馍ネ尸F(xiàn)象。本文檔共90頁；當前第47頁；編輯于星期二\11點26分超高壓汞燈本文檔共90頁；當前第48頁；編輯于星期二\11點26分熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質都有一個產生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發(fā)光照射后，在極短時間內發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。本文檔共90頁；當前第49頁；編輯于星期二\11點26分熒光濾色片組紫外光（UV）：激發(fā)光譜區(qū)域：330-400nm；

可見熒光起紿光譜：425nm紫

光（V）：激發(fā)光區(qū)域：395-415nm；

可見熒光起紿光譜：455nm藍

光（B）：激發(fā)光譜區(qū)域：420-485nm；

可見熒光起紿光譜：515nm綠

光（G）：激發(fā)光譜區(qū)域：460-550nm；

可見熒光起紿光譜：590nm本文檔共90頁；當前第50頁；編輯于星期二\11點26分熒光專用物鏡FL25X/0.65FL40X/1.0（甘油）FL100X/1.25（甘油）本文檔共90頁；當前第51頁；編輯于星期二\11點26分熒光染料：核酸：溴化乙錠、吖啶橙、PI、DAPI等。細胞骨架：鬼筆環(huán)肽。蛋白：抗原抗體免疫熒光各種熒光蛋白（GFP、YFP等）本文檔共90頁；當前第52頁；編輯于星期二\11點26分四、使用方法．1．打開燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點。

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3．放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；本文檔共90頁；當前第53頁；編輯于星期二\11點26分

4．高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。本文檔共90頁；當前第54頁；編輯于星期二\11點26分五、用途1觀察標本中的自發(fā)熒光物質或以熒光素染色或標記的細胞和結構2標本中的熒光物質在紫外線激發(fā)下產生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質在細胞和組織內的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質如神經細胞和心肌細胞等內的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細胞和視網膜色素上皮細胞內的維生素A呈綠色熒光，某些神經內分泌細胞和神經纖維內的單胺類物質（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。本文檔共90頁；當前第55頁；編輯于星期二\11點26分3細胞內的某些成分可與熒光素結合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進行細胞內DNA含量測定。

4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體（一抗或二抗），用該標記抗體直接或間接地與細胞內的相應抗原結合，以檢測該抗原的存在與分布。本文檔共90頁；當前第56頁；編輯于星期二\11點26分

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標本的單色和雙色觀察本文檔共90頁；當前第57頁；編輯于星期二\11點26分激光掃描共焦顯微鏡技術介紹：激光掃描顯微鏡是建立在光學顯微鏡及各種掃描顯微鏡基礎上的一種新型的掃描成象系統(tǒng)。采用激光作為光源，使用激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，利用聚焦的激光束在樣品表面掃描，同時利用光電檢測器件接收樣品反射光（或透射光），樣品結構的變化使反射光（或透射光）強度改變，因而使光電檢測器的輸出電流改變，經信號處理，同步顯示在計算機屏幕上。

本文檔共90頁；當前第58頁；編輯于星期二\11點26分激光物鏡標本共聚焦針孔(Pinhole)光電倍增管(PMT)熒光濾光片

(發(fā)射光濾色片)共聚焦原理本文檔共90頁；當前第59頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第60頁；編輯于星期二\11點26分掃描？X線上的熒光強度變化多條線構成2維圖像本文檔共90頁；當前第61頁；編輯于星期二\11點26分XY掃描顯微鏡Z顯示器標本62OLYMPUS本文檔共90頁；當前第62頁；編輯于星期二\11點26分標本PMTPC為什么用PMT（光電倍增管）？相比CCD，PMT擁有更高的感光效率更快的讀出速度（微秒級）PMT采集時間信息——電腦還原為位置信息本文檔共90頁；當前第63頁；編輯于星期二\11點26分共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片3.增加側向分辨率4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響本文檔共90頁；當前第64頁；編輯于星期二\11點26分寬場照明顯微鏡和共聚焦圖像比較本文檔共90頁；當前第65頁；編輯于星期二\11點26分激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:1.點照明，激光光源2.具有照明小孔和探測小孔3.照明小孔和探測小孔共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像5.無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”6.真正的三維重組7.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物

本文檔共90頁；當前第66頁；編輯于星期二\11點26分激光共聚焦顯微鏡的組成激光共聚焦顯微鏡一般由激光光源，顯微鏡和成像系統(tǒng)三部分組成本文檔共90頁；當前第67頁；編輯于星期二\11點26分激光光源Laserlines（Cofocal)

405,442,457,477,488,

514,543,568,637nm本文檔共90頁；當前第68頁；編輯于星期二\11點26分例如：藍光激光二極管405nmexcitation.HQ442/45emissionfilter(DAPI)Applicationse.g.DAPI,HoechstCFPPacificBlueothers…..本文檔共90頁；當前第69頁；編輯于星期二\11點26分

氦-氖激光(

HeNelaser)

543nm,633nm本文檔共90頁；當前第70頁；編輯于星期二\11點26分氬激光(

Arlaser)

458,477,488,514,568nm,

本文檔共90頁；當前第71頁；編輯于星期二\11點26分顯微鏡UprightMicroscopesNikonE600NikonE800NikonE1000NikonOptiphot2ZeissAxioplan2ZeissAxioskopOlympusBX50/51OlympusBX50WIOlympusBX60OlympusBH2InvertedMicroscopesNikonTE2000,TE300NikonDiaphot300ZeissAxiovert200andTVZeissAxiotechOlympusIX70andTVR本文檔共90頁；當前第72頁；編輯于星期二\11點26分激光共聚焦顯微鏡在生物學中的應用。本文檔共90頁；當前第73頁；編輯于星期二\11點26分組織光學切片本文檔共90頁；當前第74頁；編輯于星期二\11點26分三維圖像重建本文檔共90頁；當前第75頁；編輯于星期二\11點26分本文檔共90頁；當前第76頁；編輯于星期二\11點26分Cy2-anti-basementmembraneproteinCy3anti-neuronalprocessesCy5anti-bloodvesselprotein.多熒光標記分析本文檔共90頁；當前第77頁；編輯于星期二\11點26分動物細胞間的胞間通訊研究本文檔共90頁；當前第78頁；編輯于星期二\11點26分植物細胞間的胞間通訊研究植物細胞中胞間連絲相關蛋白Rab11的定位本文檔共90頁；當前第79頁；編輯于星期二\11點26分Aconfocalimageofa6-day-oldzebrafish(dorsalview)embryothathasbeendouble-labeledwithantibodiesagainstcelladhesionmoleculesshowsstainingofdifferentsubpopulationsofaxonsinthenervoussystem..PhotonicSolutionsforBiotechnologyandMedicineNovember2002本文檔共90頁；當前第80頁；編輯于星期二\11點26分活體狀態(tài)下細胞的動態(tài)變化擬南芥?zhèn)雀敹朔稚毎姆至驯疚臋n共90頁；當前第81頁；編輯于星期二\11點26分活細胞延時實驗：本文檔共90頁；當前第82頁；編輯于星期二\11點26分根據激光發(fā)生器的不同，目前可分為單光子激光共聚焦顯微鏡（ConfocallaserscanningMicroscopy

）、雙光子激光掃描顯微鏡(

two-photonexcitationMicroscopy)和多光子激光共聚焦顯微鏡（Multi-photonMicroscopy）。本文檔共90頁；當前第83頁；編輯于星