當歸注射液預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌ICAM【摘要】目的：觀察當歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細胞內ICAM-1表達的變化，探討當歸抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的機理。方法:將35只SD大鼠隨機分成4組(n=10):正常對照組(n=5)；假手術組(n=10)；缺血再灌注組(n=10)；當歸治療組(n=10),建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實驗完畢后，將各組動物心肌組織做免疫組織化學染色；觀察各組動物心肌細胞內p53蛋白表達的變化。利用HPIAS-2000圖像分析系統測定ICAM-1在以上各組中表達的平均光密度和平均陽性面積率。結果：正常對照組心肌細胞內ICAM-1表達低呈陰性；當歸治療組心肌細胞內ICAM-1表達較低呈陰性。假手術組心肌細胞內ICAM-1表達也較低呈弱陽性，缺血再灌注損傷組ICAM-1表達較高呈陽性。圖像分析結果顯示：正常對照組、當歸治療組、假手術組與缺血再灌注損傷組之間ICAM-1表達的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義()；正常對照組與假手術組之間、當歸治療組與假手術組之間ICAM-1表達的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P005)。結論：當歸注射液對大鼠缺血再灌注損傷心肌細胞有重要的保護作用。

【關鍵詞】當歸注射液缺血再灌注心肌ICAM-1表達

缺血是供血障礙引起的組織供血不足的病理表現,組織缺血導致的疾病稱缺血性疾病,是可以發生在多種組織器官上的常見疾病。再灌注是指組織缺血后恢復供血的過程,缺血再灌注實際上包括缺血和再灌注兩個方面,缺血是引起疾病的原因,也是再灌注的條件。缺血性疾病的治療需要改善供血,改善供血的過程又是再灌注的過程,往往可以加重組織的損傷［1］。

當歸的藥用價值早已為人們所認識,其藥理作用主要是：①促進機體免疫；②對呼吸系統的作用；③對血液循環系統的作用，有文獻報道［2］。冠心病患者應用當歸注射液治療能平衡和抑制血小板聚集的作用。因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性ST-T的變化,是治療冠心病的有效藥物［3］。當歸具有鈣通道阻滯作用,拮抗鈣超載,對心肌缺血再灌注所致心肌損傷有保護作用。在缺血及再灌注狀態下,心臟順應性及射血功能得到良好的保護,使反映心肌損傷程度的CPK活性和氧自由基損傷過程產生的過氧化脂質分解產物MDA的濃度大大降低［4］。中藥對心肌缺血的治療有其獨特性和有效性，尤其是中藥具有毒副作用小、效果確切的特點。近年來，有不少學者對中藥預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用進行了研究與探索。

本實驗采用免疫組織化學方法觀察當歸注射液對缺血/再灌注過程心肌的保護作用,研究當歸注射液抗心肌缺血/再灌注損傷的作用機理。旨在指導臨床合理應用當歸治療心血管疾病,開辟當歸在體外循環手術前和術中應用的新途徑。

1材料與方法1材料動物模型制備及分組

選用健康雄性Wistar大鼠35只,體重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥鈉mg·(100g)-1,麻醉動物后行氣管切開接微型呼吸機人工呼吸［呼吸頻率60次·min-1,潮氣量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左緣第4肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結扎/開放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動物隨機分成四組:正常對照組；假手術組；缺血再灌注損傷組(IR)；當歸注射液預處理組。2主要試劑

25%當歸注射液(武漢大學中南醫院制藥廠)；即用型兔抗鼠ICAM-1單克隆抗體，即用型S-P通用型免疫組織化學試劑盒，DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。以上試劑均購于北京中山生物技術有限公司。3方法常規HE染色

取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色。免疫組織化學S-P法檢測ICAM-1相關抗原

主要步驟：5μm組織切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫處理10min以抑制內源性過氧化物酶活性，ICAM-1均采用高壓抗原修復，正常羊血清處理10min以減少非特異性背景，一抗4℃孵育過夜，生物素標記的二抗處理10min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組，人乳腺癌作為ICAM-1的陽性對照組。4免疫組織化學結果判斷

ICAM-1以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統對ICAM-1抗原的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。5統計學處理

對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準α為。

2結果

HE染色

正常對照組：可見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，細胞核位于細胞中央，細胞界限清晰，結構正常；假手術組：可見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，但可見部分胞漿溶解，結構基本上正常；缺血再灌注損傷組：可見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，胞漿溶解呈空泡或網狀，細胞界限模糊，可見心肌細胞斷裂；當歸治療組：可見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，細胞核呈橢圓形位于中央，細胞結構基本正常。

ICAM-1的表達

正常對照組：心肌細胞內無棕黃色顆粒沉積，ICAM-1表達極弱或無表達；假手術組：心肌細胞內可見極少量的棕黃色顆粒，ICAM-1表達極弱；缺血再灌注損傷組：心肌細胞內有較多棕黃色顆粒，ICAM-1表達強；當歸治療組：心肌細胞內無棕黃色顆粒沉積，ICAM-1表達極弱或無表達。圖像分析結果顯示：正常對照組：ICAM-1表達的平均光密度為±，假手術組：ICAM-1表達的平均光密度為0.831±，缺血再灌注損傷組：ICAM-1表達的平均光密度為±；當歸治療組：ICAM-1表達的表達的平均光密度為±；正常對照組：ICAM-1表達的陽性面積率為±，假手術組：ICAM-1表達的陽性面積率為±，缺血再灌注損傷組：ICAM-1表達的陽性面積率為±；當歸治療組：ICAM-1表達的表達的陽性面積率為±。經單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P＜)。經q檢驗，正常對照組、當歸治療組、假手術組與缺血再灌注損傷組之間ICAM-1的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義()；正常對照組與假手術組之間、當歸治療組與假手術組之間ICAM-1平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P005)。見表1。表1當歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后各組ICAM-1表達的平均光密度和陽性面積率(略)注：*正常對照組、假手術組、當歸治療組與缺血再灌注損傷組比較，P＜；△當歸治療組、假手術組與正常對照組比較，P＞。

3討論

缺血再灌注損傷的影響因素很多,如缺血時間的長短,灌注液的成分、溫度和壓力,缺血組織器官狀態等。不同組織細胞對缺血的耐受程度不同,再灌注損傷的產生也存在差異。根據缺血再灌注時間的不同,其對心肌的影響是多方面的。缺血時間短(小于5min)心肌處于可逆的損傷,當恢復再灌注后缺血心肌的功能可以迅速恢復正常；預先短暫缺血和再灌注可以減輕后續較長時間缺血造成的損傷,即心肌缺血的預適應(ischemicprecondition,IPC)現象；較長時間缺血(通常是5～20min)尚不足以引起心肌功能、形態改變,但再灌注后可能表現為心律失常(arrhythmia)和心肌頓抑(myocardialstunning),后者是指心肌功能的可逆、延遲性抑制［5］；更長時間的心肌血供完全中斷(大于30min),則造成心肌細胞不可逆性損傷、壞死,即心肌梗死(myocardialinfarction)；慢性心肌缺血供血不足,當血供恢復正常后,心肌功能可部分或全部恢復正常,即心肌冬眠(myocardialhibernation)。心肌在缺血后數秒鐘內即可出現代謝和功能的變化,并隨著時間的推移呈進行性加重。心肌缺血早期造成的損傷是可逆的,隨著缺血時間的增加,損傷變得更為嚴重,最終導致不可逆性損傷、壞死。缺血時間越長,可逆性損傷的細胞數越少,再灌注后可能恢復正常功能的組織越少［6］。心肌缺血再灌注損傷的發病機制尚未完全闡明,目前的研究認為,心肌缺血再灌注導致線粒體能量合成障礙、Ca2+穩態紊亂和大量自由基產生,最終導致細胞凋亡或死亡［7］。

當歸含有阿魏酸、多種磷脂、人體必需氨基酸和微量元素等。目前已證明,當歸對心血管系統、血液造血系統、免疫系統、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的藥理作用。在心血管疾病中,經常發生缺血再灌注損傷,其機制可能是多因素的,但主要有三個環節:即能量代謝失常、鈣超載和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注損傷的直接原因［8］。缺血再灌注過程中,機體可通過多種途經產生氧自由基,氧自由基與生物膜發生一系列反應,可破壞心肌細胞結構、損傷心肌細胞膜,產生大量的脂質過氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷慨念以來，已逐漸引起醫學界的高度重視。大量動物實驗顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內皮細胞、一氧化氮、中性粒細胞、細胞黏附分子和細胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發病過程。目前雖然對缺血或缺血再灌注損傷的確切機制還不十分清楚,但巳經知道損傷的臨床結局主要就是細胞死亡。

ICAM-1作為白細胞功能相關抗原、巨噬細胞分化抗原-1的配體,參與白細胞與血管內皮細胞的黏附并向血管外遷移,黏附心肌細胞釋放細胞毒,表達增強的ICAM-1還可反饋作用于內皮細胞、巨噬細胞,促進細胞因子的炎癥介質的表達。ICAM-1在內皮及心肌細胞中的誘生對中性白細胞介導的缺血再灌注損傷至關重要［8］。國外研究發現,心臟缺血再灌注損傷中ICAM-1表達明顯升高,且與心肌損傷密切相關［10］。本實驗數據表明,缺血再灌注損傷模型中ICAM-1含量明顯增加。當歸治療組中ICAM-1含量明顯降低，表明當歸可下調心肌組織中ICAM-1水平,對心肌起了重要的保護作用。同時說明當歸可抑制心肌缺血再灌注時內皮細胞合成釋放細胞因子等炎癥介質,減輕心肌損傷。

心肌缺血再灌注損傷的機制研究已取得了很大的進展,隨著分子生物學、藥學等相關學科實驗技術的發展,人們將會對心肌缺血再灌注損傷的機制有更深刻的認識,找到更安全、有效的治療措施及治療藥物。相信在廣大醫藥工作者的不斷努力下,將會在祖國中醫藥寶庫中發現對心肌缺血再灌注損傷有更好保護作用的藥物。

本實驗結果為臨床防止缺血再灌注損傷提供了一個新的思路,其確切臨床價值有待于進一步的研究和證實。

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