多參數流式細胞術分析415例成人和兒童B【摘要】為了探討FCM在微量殘留病檢測中的意義，利用4-6組4色抗體組合，以CD45/SSC設門法對273例成人和142例兒童B系急性淋巴細胞白血病患者進行了多參數流式細胞術免疫分型檢測和白血病相關免疫表型分析。結果表明：根據CD34和CD10的表達特點，可將B-ALL患者分為I型；Ⅱ型；Ⅲ型；Ⅵ型。Ⅰ型和Ⅱ型患者LAIP的陽性比例分別為100%和92%，但Ⅲ型患者LAIP陽性率只有%,顯著低于Ⅰ型和Ⅱ型患者。總體B-ALL患者LAIP的檢出率為90%，成人與兒童組無明顯差異。而利用CD34/CD10/CD19/CD45一組抗體，LAIP檢出率達到%。結論：90%成人和兒童B-ALL白血病患者具有LAIP，因此對這類患者適宜用多參數流式細胞術進行MRD監測。

【關鍵詞】急性B系白血病；白血病相關免疫表型;多參數流式細胞術

Leukemia-AssociatedImmunophenotypesin415ChildhoodandAdultPatientswithBLineageAcuteLymphoblasticLeukemiaMultiparametricFlowCytometryAnalysis

AbstractToevaluatethesignificanceofFCMinminimalresidualdisease(MRD)detection,theimmunophenotypingandleukemia-associatedimmunophenotypes(LAIP)ofleukemiacellsfrom273adultand142childhoodpatientswithBlineageacutelymphoblasticleukemia(B-ALL)weredetectedbyfourtosixantibodycombinationsof4-colorCD45/SSCgatingmultiparametricflowcytometry(FCM).TheresultsshowedthattheB-ALLpatientscouldbeclassifiedinto4subtypesbasedondifferentexpressionCD34andCD10:subtypeⅠ,subtypeⅡ,subtypeⅢ,subtypeⅣ.TheLAIPwasobservedin100%and92%patientsofsubtypeⅠandsubtypeⅡ,respectively,whereasonly%insubtypeⅢ.TheincidenceofLAIPintotalB-ALLcaseswas90%byusingtheantibodiesdetectedinthisinvestigation.TherewasnosignificantcedifferentforincidenceofLAIPbetweenadultandpediatricpatients.LAIPwasobservedin%ofpatientsbylabelingonlyCD34/CD10/CD19/CD454-colorantibodycombination.Itisconcludedthatin90%ofchildhoodandadultB-ALLpatientsLAIPcanbefound,whichsuitsMRDdetectionbymultiparameterflowcytometry.

KeywordsacuteBlineageleukemia;leukemia-associatedimmunophenotypes；multiparametricflowcytometry

B細胞型急性淋巴細胞白血病免疫亞型的MIC診斷標準自1985年起一直沿用至今，并且被新的WHO分類標準所采用。該標準根據胞漿免疫球蛋白和細胞核內抗原TdT及表面免疫球蛋白、HLA-DR和CD10，將B-ALL分為：early-precursors-B-ALL,commom-B-ALL,pre-B-ALL和B-ALL4亞型。用流式細胞儀檢測胞漿抗原的表達，操作較煩瑣，有一定難度，且結果不穩定，因此其在臨床的常規檢測中應用受到限制。1997年Jennings等［1］提出將B-ALL分為：B-precursor-ALL,pre-B-ALL和B-ALL3亞型，又將B-precursor-ALL,分為CD10+和CD10-兩類。該系統在MIC基礎上加入CD34、CD20、CD22、CD24、CD9抗原。近幾年多參數流式細胞術的開發和應用促進了對正常B細胞分化階段抗原表達的認識，但是否可通過簡便的抗原檢測而達到對B-ALL進行亞型的分型，本研究對此進行了初步探討。雖然B-ALL患者的白血病細胞在抗原表達類型和出現的順序與正常B祖細胞基本相似，但白血病細胞具有一些正常細胞不存在或存在比例較低的抗原表達特點，可作為辨認白血病細胞的標志，文獻上對其稱為白血病相關免疫表型［2］。利用FCM通過檢測LAIP可對B-ALL微量殘留病進行監測，這一方法已成為與聚合酶鏈反應并用的檢測MRD的主要方法。目前國際上對B-ALL-MRD的檢測結果多來自兒童患者，而且主要的研究對象為前體B-ALL。而成人B-ALL患者在免疫表型尤其是LAIP與兒童患者是否存在區別？FCM-MRD的檢測是否同樣適合于成人B-ALL患者？及兒童和成人不同亞型B-ALL患者中LAIP的陽性率是否相同？均不十分清楚。本室在掌握了正常B祖細胞免疫表型的基礎上［3］，對415例成人和兒童B-ALL患者的上述問題進行了研究，以探討其在MRD檢測中的意義。

材料和方法

研究對象

2000年8月至2005年6月在我室進行免疫分型檢測的B-ALL患者共415例，其中初治409例，復發6例。成人組273例，中位年齡32歲，男160例，女113例。兒童組142例，中位年齡9歲，男89例，女53例。

B-ALL患者的免疫分型檢測

取肝素抗凝的骨髓或外周血標本，利用我室設計的4色熒光直接免疫標記法進行B-ALL的免疫分型檢測，以CD45/SSC設門，故每管均加CD45-PerCP抗體。主要標記4-6管4色抗體組合，檢測的抗原分別為CD19、CD10、CD34、CD20，CD22，HLA-DR、CD13、CD33、CD14、CD5、CD7、CD2、CD38、CD117，CD11b等。經流式細胞儀(FACSort型，BectonDickinson公司，裝備雙激光管)測定時將正常淋巴細胞的CD45熒光值調到103左右。每份標本獲取10000個細胞。分析時以幼稚細胞群中抗原表達細胞20%作為陽性。由于在儀器設定時將正常淋巴細胞的CD45熒光值調到103左右，此時正常B系祖細胞的CD45全部101,因此CD45抗原以90%細胞101定為CD45陽性，90%細胞101定為CD45陰性，90%細胞101到102定為CD45弱陽性。B-ALL免疫分型的診斷標準參考文獻［4］。

統計學處理

采用成對樣本t檢驗和卡方檢驗。

結果

B-ALL免疫分型

本組B-ALL患者中，CD19全部陽性。由于正常B細胞的不同分化階段CD34和CD10表達具有明顯的階段性，并且白血病細胞基本保留此特性，因此我們參考MIC分類標準，并主要根據CD34和CD10的表達，將B-ALL患者共分為4亞型：Ⅰ型:CD34+/CD10-，相當于MIC分類Early-precursor-B-ALL(Pre-pre-B-ALL);Ⅱ型:CD34+/CD10+,相當于普通B-ALL(c-B-ALL)；Ⅲ型:CD34-/CD10+，相當于前B-ALL。其它各型比例在兒童與成人和與總體相比均無顯著性差異。Table1.FrequencyofimmunophenotypicsubtypesinadultandchildpatientswithB-ALL

B-ALL患者LAIP分析

通過與正常B祖細胞進行比較［2］，在總體B-ALL中LAIP的主要表現為：①抗原表達異常，以CD45表達異常減弱，缺如最為多見，在總體B-ALL患者中占%。而且在4個亞型中均可見到，這說明完全喪失了分化階段的特性。其它抗原表達異常包括CD19、CD10、CD34異常高表達和異常低表達;②非同步抗原表達，如Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型B-ALL患者的白血病細胞，在正常CD19+B系細胞相應發育階段除CD34和CD10抗原外，CD22、CD38和CD20表達應為CD22+CD38+CD20-、CD22+CD38+CD20+/-和CD22+CD38-CD20+;但白血病細胞可出現CD34+CD20+、CD34-CD10-CD20-、CD34-CD10-CD22-、CD34+CD38-、CD10+CD38-非同步抗原表達異常；③交叉系列抗原表達，如同時表達髓系和T系標志。通過本研究所檢測的抗體，415例B-ALL患者中373例患者具有可供MRD檢測的LAIP，其中利用CD10/CD34/CD19/CD45一組抗體，LAIP的檢出率達到%。Table2.IncidenceofLAIPin415adultandchildpatientswithB-ALL

Note:st+-strongpositive.

B-ALL各亞型中白血病相關的免疫表型分析

本研究所檢測的主要抗原的異常表達在各亞型中的比例見表3和表4。CD45和CD38異常弱表達和CD34、CD19和CD10的強表達主要見于Ⅱ型患者，使Ⅱ型患者總體LAIP陽性率達%。CD33和CD56的異常表達以Ⅰ型患者多見，且正常CD19+B祖細胞基本不存在CD34+CD10-表型，此型患者全部為LAIP+，即均可通過免疫表型檢測MRD。Ⅲ型患者由于CD34陰性，CD10表達也已經減弱，只有CD20全部陰性占%,高于Ⅰ型和Ⅱ型，但其他標志異常率也較低，其總LAIP+率只有%，比Ⅰ和Ⅱ型低，但只與Ⅰ型相比有統計學差異。對Ⅳ型患者，由于其CD34和CD10均為陰性，因此失去了2個非常有意義的標志，LAIP陽性率最低。與其它3型比均有統計學差異。但我們發現6/7例患者CD20為陰性，而此期的正常B細胞，CD20應強陽性，因此通過CD20的檢測可能利于Ⅳ型患者MRD的監測。雖然表4顯示Ⅳ型患者LAIP陽性率為%，但LAIP陰性的7名患者均未檢測CD22和CD20，因此，如果每位Ⅳ型患者均檢測此兩種抗體，則實際LAIP陽性率可能會大大增加。Table3.FrequencyofLAIPpositivepatientsinsubtypeofB-ALL(略)

成人和兒童組B-ALL患者白血病相關的免疫表型分析

表4顯示成人和兒童組B-ALL患者白血病相關的免疫表型陽性比例，兒童組中LAIP陽性率為%，成人組為%,兩者無統計學差異。而兒童和成人B-ALL各亞型之間及與總體之間均無顯著差異。這一結果說明FCM同樣適合于成人B-ALL患者MRD的監測。Table4.PercentageofLAIPpositivepatientsinsubtypeofB-ALL

討論

近幾年，由于多參數FCM的建立和應用，我們對正常B細胞分化階段抗原表達有了新的認識。文獻報道和我們的結果均說明利用CD34/CD10/CD19/CD45可將正常B細胞從最早期到成熟期進行分型。而1985年提出的MIC標準所依據的抗原中CD19和HLA-DR在B細胞分化全程表達，而對B-ALL來講，HLA-DR不是一個特異性的標志，因此在診斷B-ALL進行時可不必檢測此抗原。TdT和CD10的表達在正常B祖細胞不同分化階段具有明顯的階段性，而文獻報道［5］和我們的結果證明，正常B祖細胞中CD34與TdT的表達具有一致性。雖然文獻報道pre-B-ALLTdT為陽性,而相應的同期正常B祖細胞CD34和TdT應為陰性，但Jennings等［1］與我們的結果，均顯示pre-B-ALL中CD34為陰性。這說明TdT在B-ALL中的表達喪失了分化階段特異性，因此利用CD34抗原作為亞型的分型標志優于TdT。cIg和sIg是很好的抗原標志，不足之處是cIg的標記操作較繁瑣，同時標記cIg和sIg也增加檢測費用。我們檢測了B祖細胞中cIg和sIg的表達，結果與文獻報道相同［7］，cIg表達見于CD34-CD10+階段，屬于CD19+B系分化的第Ⅱ期，sIg表達見于CD34-CD10dim階段，屬于B系分化的第Ⅲ期,因此我們主要依據CD34和CD10的表達將B-ALL患者分為4種亞型。對Ⅰ型B-ALL，我們的結果說明在正常CD19+B祖細胞中無明顯的CD34+CD10-細胞，而近幾年多參數FCM檢測的文章中也未證明存在此群細胞，但有文獻報道存在TdT+CD10+CD19-和CD34+CD10+CD19-早期幼稚細胞［5,6］。因此CD34+CD10-CD19+細胞是否屬于B細胞分化的最早期階段，尚無定論。但B系ALL患者中，有14%患者CD34陽性而CD10陰性，且與MIC分型中earlyPrecursors-B-ALL相似，故將其定為Ⅰ型。MIC分型中的c-B-ALL，指CD10陽性但cIg和sIg均陰性的患者，實際上與CD34+CD10+發育階段一致。Ⅲ型與MIC分型中的Pre-B-ALL相同。我們未系統檢測B-ALL中CD34的TdT關系，但文獻報道，Pre-B-ALL患者TdT+/-。現在看來，CD34+TdT-應屬于LAIP的一種。本組兒童B-ALL的分類結果與1993年前依據MIC標準進行分型的大宗標本的結果［8］基本一致。但當時對成人B-ALL患者的亞型分類中，由于缺乏cIg的資料，因此成人中Pre-B-ALL的比例不詳。這說明成人B-ALL中cIg的檢測并不普遍，影響了成人B-ALL的亞型分型。本研究利用CD34/CD10/CD19/CD45抗體組合，不僅可對B-ALL進行分型，又彌補了MIC中的不足，還可用于LAIP檢測和MRD隨訪。目前對CD22抗原表達的認識已有更新。Lucio［9］、McKenna［5］和我們的結果均證明，在B系祖細胞分化發育的早期，即表達CD22，且CD20主要為陰性，因此CD34+CD22+CD20-是Ⅰ期B祖細胞的正常表型，并非LAIP。而2002年發表的WHO白血病和淋巴瘤的新分類標準中［10］，還認為早期的B祖細胞為CD22陰性。1999年前發表的文章中，有將CD34和CD22同時陽性和CD34+CD22+CD20-歸于LAIP［1］。現在分析，這些應為正常表型。造成如此大差異的主要原因是CD22抗體所連接的熒光素不同，如CD22-FITC，該熒光素的熒光強度較弱。相似的原因可能造成不同的文獻某些抗原表達的差異，如髓系標志的表達。而FITC和PE標記的CD20的表達基本是一致的。FCM主要通過檢測LAIP來鑒別白血病細胞。對B-ALL患者，文獻報道LAIP主要有4種表現［11-13］：①非同步抗原同時表達，如CD34和胞漿μ鏈同時陽性;②交叉系列抗原表達，如B-ALL細胞同時表達髓系和T系標志;③抗原表達量異常,如CD10、CD34、CD19過強表達和CD38，CD45等表達缺失及低表達;④光散射信號改變,包括側向光散射、前向光散射。本研究結果中，LAIP主要表現為抗原表達量的異常，以CD45弱表達或表達缺失最為常見，其它抗原異常依次為CD19、CD38、CD10、CD34。交叉系列抗原：髓系或T系表達占24%，而CD56表達率達到21%。非同步抗原同時表達主要見于CD20與CD38。而光散射信號改變在發病時表現較明顯，但在MRD的檢測中，難以利用此標志進行鑒別。根據本研究所覆蓋的抗體數量，發現90%的B-ALL患者具有LAIP，可利用FCM檢測MRD。此比例與文獻報道相似。但已發表的文章多數只研究了前體B-ALL，而我們的分析對象是所有B-ALL患者，包括成熟型B-ALL，因此本研究更全面地反映了B-ALL的異常免疫表型特點。我們首次分析了不同亞型B-ALL患者LAIP的檢出率。結果表明，對Ⅰ型患者，100%患者適用于FCM-MRD檢測。對Ⅱ型患者，其LAIP的檢出率可達%,與文獻報道相似。但對于Ⅲ型患者，LAIP的檢出率明顯減低只有%。本組資料中，有1例檢測失敗者也屬此型。這說明部分Ⅲ型B-ALL患者難以利用FCM檢測MRD。Ⅳ型患者比例較低，如果增加CD20和CD22的檢測，可望增加此型患者FCM-MRD的檢測比例。對兒童和成人B-ALL患者，本研究材料表明：兒童和成人B-ALL的LAIP陽性率無明顯不同。這說明FCM同樣可適宜成人B-ALLMRD的檢測，而成人ALL患者預后明顯差于兒童患者，因此應加強治療后MRD的監測，以提高成人ALL患者的預后判斷。

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