食品質量安全檢測新技術第一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四課程主要內容一.現階段存在的食品質量安全問題二.食品質量安全問題中檢測技術第二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四一.現階段存在的食品質量安全問題1.轉基因食品的安全性2.食源微生物的安全性3.生物毒素的安全性4.食品原料中農藥、獸藥殘留的安全性5.抗生素、激素與有害物質殘留第三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因食品的安全性轉基因食品的概念

“轉基因”是指利用分子生物學手段將外源性基因轉移到某種特定生物體中，使其生物性狀或機能發生部分改變。轉基因食品（geneticallymodifiedfoods,GM食品）：就是以轉基因生物體直接作為食品或以其為原料加工生產的食品。第四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因食品的發展史轉基因食品的發展歷史實際上就是基因工程、轉基因技術等生物技術的發展史。

1982年，將大鼠生長激素重組基因導入小鼠受精原核內，獲得了人類歷史上第一個轉基因動物——轉基因“超級鼠”，比一般的小白鼠大一倍。1983年，世界上第一例轉基因植物（一種含有抗生素藥類抗體的煙草）在美國成功培植。1994年，孟山都(Monsanto)公司下屬Calgene公司研制的延熟保鮮轉基因番茄在美國批準上市，這是發達國家批準商業化的第一個轉基因作物。

第五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因棉花中國的轉基因羊日本研發的轉基因大豆

各種各樣的轉基因水果浙江省種植的轉基因油菜第六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

自1996年，轉基因農作物獲得批準進入田間試驗以來，全球轉基因作物研發和產業迅猛發展，創造了巨大的經濟、社會和生態效應。從此，世界上陸續有國家批準轉基因作物的種植，轉基因作物的種植面積、種類以及商業效應更是逐年攀升，這就是轉基因作物的商業化種植。自1996年轉基因作物首次商業化以來，轉基因作物面積累計達到近10億公頃，增長了80倍。

第七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因農作物的種植是現代農業發展的重要手段和重要領域。2010年國際農業生物技術應用組織服務（ISAAA）在北京發表2009年度全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢報告，認為全球第二輪生物技術發展浪潮已經開始。ISAAA報告認為，去年全球生物技術發展一個最顯著的進步是中國一項里程式的決策——轉基因抗蟲水稻和植酸玉米獲得生物安全發展證書。水稻和玉米分別是世界上最重要的糧食作物和飼料作物，因此，對二者的生物安全的認證對未來轉基因作物在中國、亞洲乃至全世界的推廣有巨大的影響。第八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四ISAAA報告顯示，去年25個國家的1400萬農民種植了1.34億公頃轉基因作物，面積較上一年增長了7%，其中90%來自發展中國家的小型農戶。性狀面積或“實際面積”達到1.8億公頃，比2008年增長了1400萬公頃。美國（6400萬公頃）、巴西（2140萬公頃）、阿根廷（2130萬公頃）分列轉基因作物種植面積的前三位，中國（370萬公頃）列第六位。

第九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四截止2008年底，我國已經批準22種國外轉基因作物進口許可證，分別是轉基因大豆GTS-40-3-2，轉基因玉米（Mon810，Bt11，Bt176，Mon863，NK603，GA21，T25，MON59122，TC1507，MON88017），轉基因油菜（Ms1Rf1、Ms1Rf2、Ms8Rf3、GT73、T45、Oxy235、Tapos19/12）和轉基因棉花（Mon531、Mon1445、Mon15985、Mon88913）。第十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2001—2008年，中國進口轉基因大豆累計超過2億噸。在中國市場上70%的大豆制品中含有轉基因成分，像大豆油、色拉油、磷脂、醬油、膨化食品等等，進入中國消費者的生活轉基因食品主要是使用轉基因大豆加工的食用油和豆制品。另外在市場上發現轉基因米粉、餅干、咖啡等，中國正在接受更多的國外轉基因食品。羞羞答答的轉基因大豆油第十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因植物的構建策略作物轉入的外源基因的類型及方法類型：轉基因作物涉及的遺傳改良性狀主要包括：抗除草劑基因占總面積的71%，抗蟲基因占28%，抗病毒基因占1%。方法：農桿菌介導法：農桿菌中有一種致瘤的環型DNA，稱為Ti質粒。被農桿菌感染的植物之所以長瘤正是由于T—DNA插入了植物染色體。從此，人們便利用這種天然的轉化體系向植物轉基因。基因槍：把所要轉入的基因包被在金粉或鎢粉上之后，利用基因槍將其打入培養細胞中來完成轉基因過程。第十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因大豆轉基因大豆的研究主要以耐除草劑和改善大豆品質為主：耐除草劑：在美國有3個轉基因大豆品種已應用，最多的是對除草劑草丁膦和草甘膦具有耐性的２個品種。2002年種植面積占美國大豆的74%。可見，目前美國的大豆生產已經基本上普及了耐除草劑的轉基因品種。

改善大豆成分：Mazur等(1999)

獲得了種子油酸相對含量高達85%的大豆新品系，而且農藝性狀優良。第十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因玉米轉基因玉米的研究主要集中于提高抗蟲性和耐除草劑方面。在美國，轉基因玉米的種植面積占玉米總種植面積的比例在35%左右。其中抗蟲Bt玉米的種植面積發展最快，所占近比例最大，2002年約占玉米種植總面積的24％；耐除草劑玉米占7％—10％之間；兼具抗蟲和耐除草劑特性的轉基因玉米品種種植規模仍然不大，近年來僅占玉米種植總面積的1％-2％。第十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

轉基因水稻

轉基因水稻的研究主要集中在以下三個方面：提高光合效率：將C4作物玉米的PEPC基因導入水稻的基因組，從而改良了水稻的光合作用效率。提高營養品質：Ye等（2000）成功地將來自其他物種的psy、cntl和lcy基因整合到水稻基因組中，解決了水稻胚乳不能合成維生素A的難題。增加抗逆性：紐約康乃爾大學的加戈等將大腸桿菌中兩種負責合成海藻糖的基因導入到秈稻中。轉基因水稻在惡劣環境條件下的生存能力比普通水稻更強。第十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四到底我國目前有多少轉基因食品？已經超過2000萬噸。目前我國極少生產糧食、油料作物等轉基因食品，只有一些轉基因抗蟲棉，但并不進入人的食物鏈。我國的轉基因食品基本上都是進口的。排在前三位的是：大豆、玉米、油菜。我國去年進口大豆3500萬噸。目前我國進口大豆主要用做加工原料，生產豆油、豆腐、豆奶等制品。第十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因食品的主要功能1.改善食品品質和加工特性2.提高農作物的抗病蟲害性能3.提高果蔬產品的耐儲存性和保鮮期4.改善發酵食品品質和風味5.改良動物性食品品質第二十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因作物的利與弊

轉基因作物的帶來的效益

ISAAA報告認為，轉基因作物已經在以下幾個重要方面做出了貢獻：（1）保證糧食安全，保證糧食價格的穩定，解決發展中國家人民的饑餓問題。世界人口數量，特別在發展中國家，還在持續增長，它帶來的糧食短缺問題，也就成為了一個全世界關注的重要問題。因此，通過基因工程技術，特別是轉基因技術，以獲得高產的優良農作物品種，可能將是解決21世紀不斷增加人口對糧食需求的重要途徑之一。第二十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（2）創造了明顯的可觀的經濟效益。轉基因農作物的發展能夠帶來明顯的經濟效益，如加拿大，在1996年種植了1200萬hm耐除草劑油菜后，產量提高9％，經濟效益達600萬美元；中國種植轉基因抗蟲棉花，從1997—2000年的4年，總的經濟效益達3．37億美元。在2000年世界轉基因作物產品的價值為3O億美元，預計2010年時價值可達800億美元。由此可見，經濟效益是十分明顯的。第二十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因食品的安全性

1.未進行較長時間的安全性試驗：基因化食品改變了我們所食用食品的自然屬性，它所使用的生物物質不是人類食品安全提供的部份，未進行長時間的安全試驗，無法確定這類食品是否安全。

英國一位科學家在著名醫學雜志《柳葉刀》上發表論文，宣稱實驗用的大鼠在食用轉基因馬鈴薯以后，肝臟受到損傷，免疫系統受到削弱，由此掀起了國際社會對轉基因食品安全性廣泛爭論的序幕。對人類健康產生的安全性問題第二十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2產生毒素：基因化食品能產生不可預見的生物突變，會在食品中產生較高水平和新的毒素。Losey,J.E.等（1999）報道，在一種植物馬利筋葉片上撒有轉基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用葉片就少，長得慢，4天的幼蟲的死亡率44%。而對照組（飼喂不撒Bt玉米花粉的葉片）無一死亡。轉基因作物產生的殺蟲毒素可由根部滲入周圍，但尚不清楚會產生何種影響，是否會對人類的健康產生影響同樣未知。第二十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3過敏或變態反應：基因技術會在食品中產生不能預見的和未知的變態反應原。據報告，對巴西堅果產生過敏的主體也會對用該堅果基因工程化而得到的大豆產生過敏。科學家把巴西胡桃的特性移植到黃豆上去，結果卻使一些對胡桃過敏的人在攝取黃豆時有過敏的可能。植物凝血素（Lectin）對有些害蟲來說是有毒的，轉基因食品不得含有此類有毒物質。

第二十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四4減少食品的營養價值或降解食品中重要的成份：基因化的目的是去除或滅活人們認為不需要的物質，這些物質可能是未知的。美國的研究資料表明，在具有抗除草劑基因的大豆中，異黃酮類激素等防癌的成份減少了。具有芳香、有光澤的紅色蕃茄能貯藏幾周，但營養價值較低。消費者在購買水果或蔬菜時，僅依靠外觀和質地，因此，不能準確判定該產品的真實質量。第二十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四5產生抗菌素耐藥性細菌：基因技術采用耐抗菌素（如抗卡那霉素、氨芐青霉素、新霉素、鏈霉素等）基因來標識轉基因化的農作物，這就意味著農作物帶有耐抗菌素的基因。荷蘭科學家發表在《新科學家》雜志的試驗結果稱，設計一人造胃，對人消化轉基因食物的過程進行模擬，發現DNA滯留在腸內，同時一些轉基因細菌能夠把自己的抗生素抗性基因轉移給人造胃的細菌。第二十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四6.副作用能對人體產生危害：Mayeno,A.N.等（1994）報告，發生一種新的，不明原因的病癥，主要表現為嗜酸性肌痛。臨床表現有麻痹、神經問題、痛性腫脹、皮膚發癢、心臟出現問題，記憶缺乏、頭痛、光敏、消瘦（Brenneman,D.E.等，1993；Love,L.A.等，1993）。后查明系日本一公司生的基因化工程細菌產生的色氨酸所致。食用者在3個月后發病，導致37人死亡，1500人體部份麻痹，5000多人發生偶爾性無力。據測定，含量為0.1%便可殺死人體。

第二十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四1

除草劑使用的增加：科學家估計，基因化的農作物對除草劑具有抵抗力，實際應藥量高于正常的3倍。農民知道其作物對除草劑有抵抗力，會大量使用除草劑。2殺蟲劑使用的增加：農作物常使用自己特有的殺蟲劑，基因化的農作物對殺蟲劑有抵抗力，這就意味著比以前有更多的殺蟲劑進入我們的食品和田野。有報導，將優良的特定的基因（如抗殺蟲劑）植入作物，可能會使周圍野生植物一并獲得改良，呈現出抗殺蟲劑的特征。對環境產生的安全性問題第二十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3基因污染：轉基因作物通過基因流可使野生近緣種變為雜草，成為“超級雜草”。有資料證明，把轉基因油菜釋放后，當大田的油菜附近有近緣雜草時，在萌發的后代種子中有93%被證實是種間雜草。第三十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四4對非目標生物有傷害，對生物多樣性形成威脅：Birch,A.等（1996/7）的實驗結果表明，用轉基因馬鈴薯飼喂蚜蟲，雌蟲的產卵量減少1/3，用喂轉基因馬鈴薯長大的雄蚜蟲與對照組蚜蟲交配，所得的未受精卵數量多4倍，已受精卵在未孵化前比對照組死亡率高近3倍，以轉基因馬鈴薯蚜蟲為食物的雌飄蟲的存活時間比對照組少一半，如果大規模的種植轉基因作物，可能會減少有益昆蟲的種群。第三十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因食品的檢測技術

轉基因植物產品的安全性評估極為重要，但可能更為受到人們關注的是轉基因產品的檢測技術。目前要測試植物產品是否含有基因改造成分，或植物產品是否經過基因改造，主要有兩種方法：

1檢測是否有外來基因或DNA；

2檢測是否有外源的蛋白質。第三十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

制訂了12項轉基因產品檢測行業標準和7項國家標準；研制并生產了10種轉基因產品檢測試劑產品；建立了轉基因產品檢測信息庫和一個轉基因產品信息網站。《大豆中轉基因成份定性PCR檢測方法》《玉米中轉基因成份定性PCR檢測方法》《油菜籽中轉基因成份定性PCR檢測方法》《煙草中轉基因成份定性PCR檢測方法》《植物性飼料中轉基因成份定性PCR檢測方法》《馬鈴薯中轉基因成份定性PCR檢測方法》《棉花中轉基因成份定性PCR檢測方法》第三十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四食源微生物的安全性時間微生物名稱食品源感染人數國家1984 鼠傷寒沙門氏菌 沙拉醬 美國1985 鼠傷寒沙門氏菌

巴氏消毒奶 170000 美國1989 金黃色葡萄球菌 蘑菇罐頭 美國1991 甲肝病毒 毛蚶 300000 中國1994 腸炎沙門氏菌巴氏消毒液態冰激凌 224000 美國1996 大腸桿菌O157:H7 蘿卜 8000 日本1997 腸炎沙門氏菌 蛋和肉制品 2013 比利時2000

金黃色葡萄球菌 雪印牛奶 日本2001 單增李斯特菌 法國世界上食源微生物感染群發事件第三十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四根據WHO估計：發達國家食源性疾病的漏報率在90%以上發展中國家食源性疾病的漏報率95%以上“冰山一角”第三十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四沙門氏菌（禽、畜肉）副溶血性弧菌（水產品）蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌（剩飯）肉毒梭菌（發酵制品、肉制品）單核細胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品）大腸桿菌O157:H7（肉制品）等。微生物性食物中毒常見的致病菌和食物：第三十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四方法修訂征求意見文本GB4789.2 菌落總數測定GB4789.3.1 大腸菌群測定GB4789.3.2 糞大腸菌群測定GB4789.3.4 大腸桿菌檢驗GB4789.10.1 金黃色葡萄球菌定性檢驗GB4789.10.2 金黃色葡萄球菌定量檢驗第三十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四生物毒素的安全性

也稱作真菌毒素（Mycotoxins）Mykes:Greekforfungus/mold希臘語“霉菌”Toxicum:Latinforpoison/toxin拉丁文“毒素”第三十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

真菌毒素（Mycotoxin），有時也俗稱霉菌毒素，是某些真菌產生的代謝產物，目前已發現的真菌毒素有十多種，它們包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮（也稱為嘔吐毒素）、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、麥角堿、雜色曲霉素、黃米毒素、島青霉毒素、展青霉毒素（棒曲霉毒素）、橘青霉素、皺褶青霉素、黃綠青霉素、紅矢精、黃綠素、圓弧青霉偶氮酸和F-2毒素等。

第三十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四能夠產生真菌毒素的霉菌1）曲霉屬（AspergillusLink）：黃曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、赭曲霉（A.ochraceus）、雜色曲霉（A.flavus）、煙曲霉（A.flumigatus）、構巢曲霉（A.nidulans）和棒曲霉（A.clavus）等。2）青霉屬（PenicilliumLinkexFr）：島青霉（P.islandicum）、橘青霉（P.citrinum）、紅色青霉（P.rubrum）、展青霉（P.patulum）和黃綠青霉（P.citreo-vinide）等。3）鐮刀菌屬（FusariumLinkexFr）：禾谷鐮刀菌（F.graminearun）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）、茄病鐮刀菌（F.solani）、三線鐮刀菌（F.tritinctum）和鑣草鐮刀菌（F.sporotrichioides）等。第四十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四玉米上的曲霉屬（Aspergillus)第四十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四玉米上的鐮刀菌屬

（Fusarium)第四十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四玉米上的赤霉素

（Gibberella)第四十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四Aflatoxin黃曲霉毒素ProducedbyAspergillusflavusandA.parasiticus由黃曲霉和寄生曲霉產生Fivekeyaflatoxins(五種黃曲霉毒素):B1,B2,G1,G2andM1Foundincorn,grains,cottonseed,peanuts,treenuts,spices,milk玉米、谷物、棉籽、花生、堅果、調味品、牛奶中均已發現Liverdamage對肝有損害IARC-class1humancarcinogen國際腫瘤研究機構定為一級致癌物第四十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素的化學性質黃曲霉毒素的基本結構為二呋喃環和香豆素，在紫外線下，黃曲霉毒素B1、B2發蘭色熒光，黃曲霉毒素G1、G2發綠色熒光。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在體內經過羥化而衍生成的代謝產物。黃曲霉毒素的分子量為312-346。難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中較穩定，但在強酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的強堿溶液中分解迅速。其純品為無色結晶，耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為268oC，紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。第四十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素在各國商品中的存在情況

(1)商品

國家

文獻發表年份

被分析的樣品數

出現率（%）

含量范圍(μg/kg)玉米印度19972074475-666玉米阿根廷19962271205-560花生印度19962062455-833花生粉印度1995380978-6280棉籽粉英國199721715-25干椰子粉菲律賓1995910023-186巴西果美國1993176170-619Pistachio果芬蘭199629592-165第四十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素在各國商品中的存在情況(2)商品

國家

文獻發表年份

被分析的樣品數

出現率（%）

含量范圍（μg/kg）杏仁美國19934410-372大豆阿根廷199194101-36大米厄瓜多爾19979997-40小麥烏拉圭1996123202-20干無花果奧地利1993136131-350肉豆蔻日本199367430-17Chillies果巴基斯坦1995176661-80第四十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四Aspergillusflavus黃曲霉五顆表面消毒的花生置于營養培養基中，其中兩顆有長出黃曲霉（黃綠色霉菌）第四十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素的毒害作用黃曲霉毒素對天竺鼠肝臟的影響，從上排的最左邊到下排的最右邊，同一時間內攝入的黃曲霉毒素量逐步增加。請注意：攝入的黃曲霉毒素量越大，天竺鼠肝臟越蒼白。第四十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素的毒性1.一級致癌物質。2.是氰化鉀的10-20倍。3.是砒霜的68倍。4.是農藥1605、1059的28-33倍。5.是3，4-苯并芘的4000倍。6.是二甲基亞硝胺的75倍。第五十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒癥（一）動物年齡黃曲霉毒素(mg/kg.bw)喂飼時間毒性作用小牛斷乳0.22-2.216周發育遲緩、死亡、肝損傷小公牛2歲0.22-0.6620周肝損傷奶牛2歲2.47個月肝損傷鴨0.2346周肝損傷、死亡第五十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四黃曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒癥（二）動物年齡黃曲霉毒素(mg/kg.bw)喂飼時間毒性作用豬新生0.2344天發育遲緩豬2周0.1723周厭食、黃疸、腹水、發育遲緩豬4-6周0.41-0.693-6個月發育遲緩、肝損傷雞1周0.8410周發育遲緩、肝損傷雞2天0.240天長瘤第五十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四Ochratoxin赭曲霉毒素ProducedbyAspergillusochraceusandPenicilliumviridicatum

由赭色曲霉菌和青霉菌產生Foundincerealgrains,coffee,pigproducts,

driedvinefruit,wine可在谷物、咖啡、豬肉產品、葡萄干和酒中發現Nephrotoxin(kidneytoxin)腎毒素LinkedtoBalkanendemicnephropathy與巴爾干腎病有關IARC—possiblehumancarcinogen

國際腫瘤研究機構認定為2B類致癌物第五十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四赭曲霉毒素的化學性質

包括7種結構類似的化合物。其中赭曲霉毒素A(R1=C1，R2=H)毒性最大，在霉變谷物、飼料等最常見。赭曲霉毒素A是一種無色結晶化合物。可溶于極性有機溶劑和稀碳酸氫鈉溶液。微溶于水。其苯溶劑化物熔點94～96℃，二甲苯中結晶熔點169℃。有很高的化學穩定性和熱穩定性。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食（小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等）、花生、蔬菜（豆類）等農作物上的曲霉和青霉產生的。動物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害動物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。還在動物試驗中觀察到它的致畸作用。第五十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四赭曲毒素A在各種商品中的存在情況（1）商品

國家

文獻發表年份

被分析的樣品數

出現率（%）

含量范圍(μg/kg)大麥德國1998679725-27000小麥丹麥1997508050-4550黑麥丹麥19972662910-2124燕麥丹麥19971212042-350小麥瑞士19971533473-2395大麥/小麥英國19972405650-34868綠咖啡日本19973574100-1740第五十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四赭曲毒素A在各種商品中的存在情況（2）商品

國家

文獻發表年份

被分析的樣品數

出現率（%）

含量范圍(μg/kg)綠咖啡英國1997225050-5787可可粉英國199650100225-37000干果英國19964898600-37650酒德國19966489550-6320調味品/本草植物德國1996317276-7132第五十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四二.食品質量安全問題中檢測技術分子生物學檢測技術基因檢測免疫學檢測化學檢測技術第五十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四基因檢測技術：1.PCR法2.分子雜交法3.基因芯片法第五十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR法第五十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR的概念PCR技術的創建PCR的原理PCR的反應體系和方法PCR的類型和應用第六十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

多聚酶鏈式反應（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶

第六十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術的創建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。

1983年,Mullis發明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第六十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產品法醫學檢測人類學研究……PCR技術誕生所依賴的社會需求和研究需要第六十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年第六十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四94℃變性50-65℃退火XX℃延伸第六十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術第六十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四72℃94℃55℃PCR循環第六十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術的原理1PCR技術的基本原理無細胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環,每一次循環使特異區段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經過30次循環,最終使基因放大了數百萬倍;擴增了特異區段的DNA帶。

第六十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四加熱變性復性復溫DNA的變性和復性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復,這稱DNA復性,也叫退火。

第六十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火第七十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2PCR技術的特點1）高度的靈敏性30輪循環擴增量達230個拷貝PCR產物每輪循環增加一倍第七十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2）特異性引物引物引物的序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結果的關鍵。引物設計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。第七十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四引物設計：（1)序列應位于高度保守區,與非擴增區無同源序列。（2）引物長度以18-30bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內部避免形成二級結構。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制。第七十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構建含有目的的基因的載體,然后將它導入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經過DNA內切、連接、轉化和培養等相關的過程,操作復雜,一般需要數周時間。第七十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四4）用途廣泛生命學科醫學工程遺傳工程疾病診斷法醫學考古學第七十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR的反應體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環,每一次循環使特異區段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經過30次循環,最終使基因放大了數百萬倍;將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區段的DNA帶。

第七十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

總體積50-100lBuffer緩沖液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶

1反應體系第七十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程第七十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環25～35次第七十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四瓊脂糖凝膠電泳PCR技術的基本過程(3)第八十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四1）PCR反應成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。3PCR反應條件第八十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量。第八十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應產量dNTP可與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。第八十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。第八十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2）循環參數變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。第八十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（3）延伸70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環次數主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加第八十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四經典循環參數（500bp以內）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever第八十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四1）不對稱PCR

目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針

基因組DNA結構功能的研究PCR的類型第八十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

高濃度引物低濃度引物第八十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列第九十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶第九十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3）多重PCR（復合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。第九十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四電泳引物12341234第九十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標本的基因診斷可同時檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4第九十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四標記引物ＰＣＲ觀察PCR產物第九十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四5）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增第九十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四基因mRNA蛋白質多肽鏈第九十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四6)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對結果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發光源和熒光信號檢測系統的PCR儀,通常配有電腦系統及相應的分析軟件。第九十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監控對樣品擴增的整個過程進行實時監控,能夠實時地觀察到產物的增加,直觀地看到反應的對數期降低反應的非特異性使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合,提高了PCR反應的特異性增加定量的精確性全程監控,準確的算法進行定量結果分析更加快捷方便,無需跑膠

第九十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四全新4通道實時熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀第一百頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術的應用1)基因克隆重組DNA質粒DNA基因片段第一百零一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產品第一百零二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四5’5’BamHIBamHIBamHIBamHI第一百零三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四GTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG質粒DNA目的基因限制性核酸內切酶第一百零四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2)基因檢測A’內源性病變基因正常人A病人第一百零五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四A正常人病人正常病人第一百零六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3）基因鑒定女性男性Y引物PCR男性女性第一百零七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術在食品安全檢測中的應用方法步驟：1、運用化學手段對DNA提取；2、設計并合成引物；3、進行PCR擴增；4、克隆并篩選鑒定PCR產物；5、DNA序列分析。第一百零八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉基因食品的檢測《大豆中轉基因成份定性PCR檢測方法》《玉米中轉基因成份定性PCR檢測方法》《油菜籽中轉基因成份定性PCR檢測方法》《煙草中轉基因成份定性PCR檢測方法》《植物性飼料中轉基因成份定性PCR檢測方法》《馬鈴薯中轉基因成份定性PCR檢測方法》《棉花中轉基因成份定性PCR檢測方法》第一百零九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四原理：標記基因的PCR檢測1.報告基因GUS基因熒光素酶(LUC)基因胭脂堿合成酶(NOS)基因GFP基因2.抗性基因第一百一十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一百一十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四PCR技術在微生物學中的應用一.微生物檢測1.常規PCR檢測在1992年Rahn

等利用沙門氏菌的invA基因設計了一對引物,第一次用PCR的方法對沙門氏菌進行了檢測試驗。共檢測了630株沙門氏菌,約100多種血清型和21個菌屬的142株非沙門氏菌。結果顯示,有兩株沒有檢測出,檢出率為99.14%。第一百一十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2.多重PCRCortez等（2006）用多重PCR檢測了家雞屠宰場不同來源樣品中的鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和其他血清型的沙門氏菌。其使用了3對引物,分別來自沙門氏菌的invA,pefA和sefA

基因。在檢測的288份樣品中,鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的檢出率為62%,其他血清型的沙門氏菌為10%。第一百一十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3.巢式PCR

巢式PCR(nestingPCR)是指先后用兩套引物進行擴增的PCR技術,用內外兩對引物先后擴增靶基因片段。通常是先用第一套引物擴增15-30個循環,再用已擴增的DNA片段內設定的第二套引物擴增15-30個循環。由于第二套引物設計片段位于第一套引物擴增的片段內,所以將第一套引物稱為外引物,而把第二套引物叫做內引物。巢式PCR既可增加反應的物異性,又可得到豐產的特異性靶序列,增加敏感性。巢式PCR技術對微生物的檢測和單拷貝基因靶DNA的擴增都是非常有效。第一百一十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

Hashimoto等（1995）基于編碼Vi抗體的基因序列改進了巢式PCR,所有的傷寒菌(包括丙型副傷寒)都能檢出,靈敏度可以達到單個細胞水平。Prakash（2005）的研究設計了腸沙門氏菌Typhi血清型菌株的H12d特異引物對進行巢式PCR,結果顯示,該巢式PCR能夠代替Widal測試方法診斷傷寒癥。第一百一十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四4.熒光定量PCR

Nam等[10]建立和評價了SYBRGreen1實時PCR特異檢測沙門氏菌的方法。用大小為119bp的invA基因作為檢測靶點,對124株沙門氏菌和116株非沙門氏菌進行了檢測。檢測結果顯示,所有的沙門氏菌有invA基因陽性條帶,而非沙門氏菌均沒有擴增條帶。第一百一十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四5.熱起動PCR

熱起動PCR(HotstartPCR)指的是使TaqDNA聚合酶只在樣品溫度超過至少70℃時才發揮作用的PCR。它是為提高反應的特異性設計的。如所周知道,TaqDNA聚合酶通常在比適宜溫度低得多的條件下仍有較強的活性,會導致非靶序列的擴增,影響PCR反應的特異性。熱起動可減少非靶序列的擴增,從而提高反應的特異性。

Yang等（2006）設計了12對引物進行多重PCR,并使用了熱啟動酶,檢測臘樣芽孢桿菌毒素基因。該體系成功的檢測出了與食物中毒及與食品相關的162株菌中潛在的毒素。第一百一十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四二.微生物分類鑒定

在釀造工業中，對于保持發酵持久度的一致性和全體產品質量的一致性來說，從非釀酒酵母菌株中純化釀酒酵母菌株是必要的。傳統的基于形態、生理生化的檢測和分類鑒定方法常常比較耗時且結論也不確定和完全，特別是難于從表現型上區分Saccharomyces屬的S.cerevisiae，S.bayanus和S.diastaticus，因為這些釀酒酵母它們屬于同一個屬。Yamagishi等應用標定FLO1的開放閱讀框架的PCR法來區分釀酒酵母和非釀酒酵母，PCR分子水平的顯示結果表明了二者的不同第一百一十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四展望

PCR技術和以PCR技術為基礎的分子生物學技術給現代生物學的研究帶來了革命性的變化，微生物學自然也不例外，它們給微生物學的研究開辟了一個新的天地，微生物由于個體微小和本身研究的特殊性，相對與其他學科來說更需要PCR技術和以PCR技術為基礎的分子生物學技術。相信隨著科學技術的進一步發展及其在微生物學應用領域的擴大，它們必將發揮出更大的作用。第一百一十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四核酸分子雜交技術SOUTHERNNORTHERN第一百二十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一節

核酸分子雜交的基本原理第一百二十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四原理：堿基互補配對原則第一百二十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

一、核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交。雜交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之間的雜交。第一百二十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四復性RNADNA第一百二十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四待測核酸序列探針(probe)：已知核酸序列第一百二十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四二、DNA的變性(denaturation)

定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。方法：過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、甲酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。

變性后其它理化性質變化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失第一百二十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂

第一百二十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，在這一范圍內，雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。第一百二十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四計算公式Tm=（G+C）%×0.41+69.3第一百二十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四三、DNA的復性DNA復性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing)。減色效應

DNA復性時，其溶液OD260降低。第一百三十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性不同來源的DNA分子第一百三十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一百三十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第二節

核酸分子雜交的基本方法第一百三十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四核酸分子雜交的類別（一）DNA印跡技術(Southernblotting)

用于基因組DNA的定性定量分析、酶切圖譜分析、基因突變分析及限制性片段長度多態性分析（RFLP）等。（二）RNA印跡技術(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。

蛋白質的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究。第一百三十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)第一百三十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（一）Southern印跡雜交

DNA印跡E.Southern 1975年第一百三十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當的限制性內切酶消化水解基因組DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待測DNA樣品的電泳分離。（3）凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段始終保持雙鏈結構。電泳結束后DNA變性并轉移到適當的固定支持物上才能進行Southernblot。變性通常用堿變性法。第一百三十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（4）Southern轉膜：將凝膠中的DNA進行堿變性并將PH恢復中性后，即可將凝膠中DNA轉移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素（NC）膜、尼龍膜、化學活化膜和濾紙等。轉移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉印跡法、真空轉移法。（5）已知序列的DNA探針的制備第一百三十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能夠結合DNA的膜同樣可以和探針DNA結合，在進行雜交實驗前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉。（7）雜交結果的檢測：采用核素標記的探針或發光劑標記的探針進行雜交時，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經沖洗，在X線片上可見黑色條帶。第一百三十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四方法1.酶解DNA限制性內切酶（RestrictionEnzyme,RE）限制性片段長度多態性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）第一百四十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四2.分離電泳

在電場中帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現象稱為電泳（electrophoresis）。

第一百四十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四3.凝膠中核酸的變性堿變性中和處理第一百四十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四4.轉膜硝酸纖維素膜尼龍膜第一百四十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四轉膜方法毛細管虹吸印跡法電轉印法真空轉移法第一百四十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四毛細管虹吸印跡法

第一百四十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四電轉印法

第一百四十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四真空轉移法第一百四十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四5.雜交預雜交：封閉非特異性DNA位點。雜交第一百四十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四6.雜交結果的檢測放射自顯影照片第一百四十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一百五十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四（二）Northernblot和Southernblot不同在于：A：靶核酸是RNA；B：RNA電泳時，凝膠中加入變性劑，防止

RNA分子形成二級結構；C：電泳結束后直接轉膜。第一百五十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四一、原理第一百五十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一百五十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四三種印跡技術的比較第一百五十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第三節探針第一百五十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料等標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。第一百五十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四一、核酸探針的來源

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針第一百五十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四二、核酸探針的標記物?①高度靈敏性；②標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與模板的結合能力及結合的特異性；③當用酶促方法進行標記時，應對酶促活性（Km值）無多大影響，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學穩定性，保存時間長，標記及檢測方法簡單；⑥對環境無污染，對人體無損傷；⑦價格低廉等。第一百五十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四常用的探針標記物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：熒光、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。第一百五十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四放射性核素標記物（靈敏度極高）①32P：釋放β-粒子,能量高,穿透力極強。②35S：35S的放射性亦較強，但β-粒子能量較低，因此其檢測靈敏度較32P稍低。③3H：適用于細胞原位雜交。④125I和131I：碘放射性同位素在70年代曾被廣泛應用于核酸探針的標記。第一百六十頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四非放射性標記物無放射性污染，穩定性好①半抗原：生物素、地高辛②配體：生物素③熒光素：④化學發光物質，可以像放射性核素一樣直接對X光膠片進行曝光。⑤光密度或電子密度標記物：如金、銀等，適用于細胞原位雜交，可以在光鏡或電鏡下進行觀察。第一百六十一頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四核酸分子雜交信號的檢測放射性同位素標記探針

放射自顯影非放射性同位素標記探針

偶聯反應+顯色反應第一百六十二頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一百六十三頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四第一百六十四頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四分子雜交的應用:1.轉基因檢測2.微生物檢測分子雜交的限制性第一百六十五頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四基因芯片分析的理論與方法第一百六十六頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四基因芯片概論第一百六十七頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四基因芯片分析的概念基因芯片(Genechip)技術是指通過微陣列(Microarray)技術將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監測等方面研究的技術。第一百六十八頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四基因芯片發展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray第一百六十九頁，共一百八十六頁，編輯于2023年，星期四