動物疫病實驗室檢驗采樣方法ny/t541—2002前言動物病料樣品的采集是動物疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查或免疫監(jiān)測所不可缺少的重要步驟，在各國的獸醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中都把這一部分納入第一重要內(nèi)容，廣泛應(yīng)用于動物疾病流行病學(xué)調(diào)查、動物檢疫和科研教學(xué)。世界動物衛(wèi)生組織[worldorganizationforanimalhealth（英），officeintentionaldesepizootic（法），oie]推薦的診斷方法中，也將該部分內(nèi)容列為第一部分內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（oie）《診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》（2000版）（manualofstandardsfordiagnostictestsandvaccines，2000）第1·1.1章"samplingmethods"的技術(shù)要求編寫的。本標(biāo)準(zhǔn)與該章的非原則性差異在于：——本標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合本國實踐經(jīng)驗對操作程序和條件作了更具體的陳述和規(guī)定；——本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)gb/t1.1-2000的規(guī)定和漢語習(xí)慣將該章的陳述性文本改為規(guī)范性標(biāo)準(zhǔn)文件。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄a為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部動物檢疫所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人。吳延功、杜元釗、朱萬光、劉佩蘭、仰惠芬。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物疫病診斷實驗室的樣品采集方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于病因（原）學(xué)、病理組織學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)等實驗室檢驗所需樣品的采集。2樣品采集的一般原則和采集前的準(zhǔn)備2.1樣品采集所遵循的一般原則2.1.1凡發(fā)現(xiàn)患畜（包括馬、牛、羊及豬等）有急性死亡時，如懷疑是炭疽，則不可隨意解剖，應(yīng)采取患畜的血液，萬不得已時局部解剖作脾臟觸片的顯微鏡檢查。只有在確定不是炭疽后，方可進(jìn)行剖檢。2.1.2采取病料的種類，根據(jù)不同的疾病或檢驗?zāi)康模善湎鄳?yīng)的臟器、內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他材料；進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、抗體檢測、動物群體健康評估或環(huán)境衛(wèi)生檢測時，樣品的數(shù)量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)的要求。采樣時應(yīng)小心謹(jǐn)慎，以免對動物產(chǎn)生不必要的剌激或損害和對采樣者構(gòu)成威脅。在無法估計病因時，可進(jìn)行全面的采集。檢查病變與采集病料應(yīng)統(tǒng)籌考慮。2.1.3內(nèi)臟病料的采取，如患畜已死亡，應(yīng)盡快采集，最遲不超過6h。2.1.4血液樣品在采集前一般禁食8h。2.1.5應(yīng)做好人身防護(hù)，嚴(yán)防人畜共患病感染。2.1.6應(yīng)防止污染環(huán)境，防止疫病傳播，做好環(huán)境消毒和病害肉尸的處理。2.2使用器械的消毒刀、剪、鑷子等用具煮沸消毒30min，使用前用酒精擦拭，用時進(jìn)行火焰消毒。器皿（玻制、陶制等）經(jīng)103kpa高壓30min，或經(jīng)160℃干烤2h滅菌；或放于0.5%～1%的碳酸氫鈉（nahco3）水中煮沸10min～15min，水洗后，再用清潔紗布擦干，保存于酒精、乙醚等溶液中備用。注射器和針頭放于清潔水中煮沸30min。一般要求使用"一次性"針頭和注射器。采取一種病料，使用一套器械與容器，不可用其再采其他病料或容納其他臟器材料。采過病料的用具應(yīng)先消毒后清洗。檢查過傳染性海綿狀腦病的器械要放在2mol/l的氫氧化納（naoh）溶液中浸泡2h以上，才可再使用。3樣品的采集3.1血液3.1.1采血部位大的哺乳動物可選用頸靜脈或尾靜脈采血，也可采脛外靜脈和乳房靜脈血。毛皮動物小量采血可穿刺耳尖或耳殼外側(cè)靜脈，多量采血可在隱靜脈采集，也可用尖刀劃破趾墊10.5cm深或剪斷尾尖部采血。嚙齒類動物可從尾尖采血，也可由眼窩內(nèi)的血管叢采血；兔可從耳背靜脈、頸靜脈或心臟采血。禽類通常選擇翅靜脈采血，也可通過心臟采血。3.1.2采血方法對動物采血部位的皮膚先剃毛（拔毛），75%的酒精消毒，待干燥后采血，采血可用針管、針頭、真空管或用三棱針穿刺，將血液滴到開口的試管內(nèi)。禽類等的少量血清樣品的采集，可用塑料管采集。用針頭刺破消毒過的翅靜脈，將血液滴到直徑為3mm～4mm的塑料管內(nèi)，將一端封口。3.1.3采血種類3.1.3.1全血樣品進(jìn)行血液學(xué)分析，細(xì)菌、病毒或原蟲培養(yǎng)，通常用全血樣品，樣品中加抗凝劑。抗凝劑可用0.1%肝素、阿氏液（見第a.l章）（阿氏液為紅細(xì)胞保存液，使用時，以1份血液加2份阿氏液），或枸櫞酸鈉（3.8%～4%的枸櫞酸鈉0.1ml，可抗1ml血液）。采血時應(yīng)直接將血液滴入抗凝劑中，并立即連續(xù)搖動，充分混合。也可將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶內(nèi)，震蕩脫纖維蛋白。3.1.3.2血清樣品進(jìn)行血清學(xué)試驗通常用血清樣品。用作血清樣品的血液中不加抗凝劑，血液在室溫下靜置2h～4h（防止曝曬），待血液凝固，有血清析出時，用無菌剝離針剝離血凝塊，然后置4℃冰箱過夜，待大部分血清析出后取出血清，必要時經(jīng)低速離心分離出血清。在不影響檢驗要求原則下可因需要加入適宜的防腐劑。做病毒中和試驗的血清避免使用化學(xué)防腐劑（如硼酸、硫柳汞等）。若需長時間保存，則將血清置20℃以下保存，但要盡量防止或減少反復(fù)凍融。樣品容器上貼詳細(xì)標(biāo)簽。3.1.3.3血漿的采集采血試管內(nèi)先加上抗凝劑（每10ml血加檸檬酸鈉0.04g～0.05g），血液采完后，將試管顛倒幾次，使血液與抗凝劑充分混合，然后靜止，待細(xì)胞下沉后，上層即為血漿。3.2一般組織3.2.1采樣方法用常規(guī)解剖器械剝離死亡動物的皮膚，體腔用消毒的器械剝開，所需病料按無菌操作方法從新鮮尸體中采集。剖開腹腔后，注意不要損壞腸道。作病原分離用。進(jìn)行細(xì)菌、病毒、原蟲等病原分離所用組織塊的采集，可用一套新消毒的器械切取所需器官的組織塊，每個組織塊應(yīng)單獨放在已消毒的容器內(nèi)，容器壁上注明日期、組織或動物名稱。注意防止組織間相互污染。3.2.2采樣種類3.2.2.1病原分離樣品的采集用于微生物學(xué)檢驗的病料應(yīng)新鮮，盡可能的減少污染。用于細(xì)菌分離的樣品的采集，首先以燒紅的刀片燙烙臟器表面，在燒烙部位刺一孔，用滅菌后的鉑耳伸入孔內(nèi)，取少量組織或液體，作涂片鏡檢或劃線接種于適宜的培養(yǎng)基上。3.2.2.2組織病理學(xué)檢查樣品的采集采集包括病灶及臨近正常組織的組織塊，立即放入10倍于組織塊的10%福爾馬林溶液中固定。組織塊厚度不超過0.5cm，切成1cm2～2cm2（檢查狂犬病則需要較大的組織塊）。組織塊切忌擠壓、刮摸和用水洗。如作冷凍切片用，則將組織塊放在0℃～4℃容器中，盡快送實驗室檢驗。3.3腸內(nèi)容物或糞便腸道只需選擇病變最明顯的部分，將其中的內(nèi)容物棄去，用滅菌生理鹽水輕輕沖洗；也可燒烙腸壁表面，用吸管扎穿腸壁，從腸腔內(nèi)吸取內(nèi)容物，將腸內(nèi)容物放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液（見第a.2章）中送檢。或者，將帶有糞便的腸管兩端結(jié)扎，從兩端剪斷送檢。從體外采集糞便，應(yīng)力求新鮮。或者，用拭子小心地插到直腸粘膜表面采集糞便，然后將拭子放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。3.4胃液及瘤胃內(nèi)容物3.4.1胃液采集胃液可用多孔的胃管抽取。將胃管送入胃內(nèi)，其外露端接在吸引器的負(fù)壓瓶上，加負(fù)壓后，胃液即可自動流出。3.4.2瘤胃內(nèi)容物采集2反芻動物在反芻時，與食團(tuán)從食道逆入口腔時，立即開口拉住舌頭，另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃內(nèi)容物。3.5呼吸道應(yīng)用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或氣管內(nèi)的分泌物，蘸取分泌物后立即將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。常用的保存液有ph7.2～7.4的滅菌肉湯（見第a.3章）或磷酸鹽緩沖鹽水，如準(zhǔn)備將待檢標(biāo)本接種組織培養(yǎng)，則保存于含0.5%乳蛋白水解物的漢克氏（hanks）液中。一般每支拭子需保存液5ml。3.6生殖道可采集陰道或包皮沖洗液，或者采用合適的拭子，有時也可用尿道拭子采集。3.7眼睛眼結(jié)膜表面用拭子輕輕擦拭后，放在滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。有時，也采取病變組織碎屑，置載玻片上，供顯微鏡檢查。3.8皮膚病料直接采自病變部位，如病變皮膚的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。3.9胎兒將流產(chǎn)后的整個胎兒，用塑料薄膜、油布或數(shù)層不透水的油紙包緊，裝入木箱內(nèi)，立即送往實驗室。3.10小家畜及家禽將整個尸體包入不透水塑料薄膜、油紙或油布中，裝入木箱內(nèi)，送往實驗室。3.11骨需要完整的骨標(biāo)本時，應(yīng)將附著的肌肉和韌帶等全部除去，表面撒上食鹽，然后包入浸過5%石炭酸溶液的紗布中，裝入不漏水的容器內(nèi)送往實驗室。3.12腦、脊髓3.12.1全腦、脊髓的采集如采取腦、脊髓做病毒檢查，可將腦、脊髓浸入30%甘油鹽水液中或?qū)⒄麄€頭部割下，包入浸過消毒液的紗布中，置于不漏水的容器內(nèi)送往實驗室。3.12.2腦、脊髓液的采集3.12.2.1采樣前的準(zhǔn)備采樣使用特制的專用穿刺針，或用長的封閉針頭（將針頭稍磨鈍，并配以合適的針芯）；采樣前，術(shù)部及用具均按常規(guī)消毒。3.12.2.2采樣方法3.12.2.2.1頸椎穿刺法。穿刺點為環(huán)樞孔。將動物實施站立或橫臥保定，使其頭部向前下方屈曲，術(shù)部經(jīng)剪毛消毒，穿刺針與皮膚面呈垂直緩慢刺入。將針體刺入蛛網(wǎng)膜下腔，立即拔出針芯，腦脊髓液自動流出或點滴狀流出，盛入消毒容器內(nèi)。3.12.2.2.2腰椎穿刺法。穿刺部位為腰薦孔。實施站立保定，術(shù)部剪毛消毒后，用專用的穿刺針刺入，當(dāng)刺入蛛網(wǎng)膜下腔時，即有腦脊髓液滴狀滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器內(nèi)。3.12.2.3采樣數(shù)量大型動物頸部穿刺一次采集量35ml～70ml，腰椎穿刺一次采集量15ml～30ml。3.13液體病料采集膽汁、膿、粘液或關(guān)節(jié)液等樣品時，用燙烙法消毒采樣部位，用滅菌吸管、毛細(xì)吸管或注射器經(jīng)燙烙部位插入，吸取內(nèi)部液體材料，然后將材料注入滅菌的試管中，塞好棉塞送檢。也可用接種環(huán)經(jīng)消毒的部位插入，提取病料直接接種在培養(yǎng)基上。供顯微鏡檢查的膿、血液及粘液抹片的制備方法。先將材料置玻片上，再用一滅菌玻棒均勻涂抹或另用一玻片推抹。組織塊、致密結(jié)節(jié)及膿汁等亦可在兩張玻片中間，然后沿水平面向兩端推移。用組織塊作觸片時，持小鑷將組織塊的游離面在玻片上輕輕涂抹即可。3.14乳汁乳房先用消毒藥水洗凈（取乳者的手亦應(yīng)事先消毒），并把乳房附近的毛刷濕，最初所擠的3～4把乳汁棄去，然后再采集10ml左右乳汁于滅菌試管中。進(jìn)行血清學(xué)檢驗的乳汁不應(yīng)凍結(jié)、加熱或強(qiáng)烈震動。3.15精液精液樣品用人工方法采集，所采樣品應(yīng)包括"富精"部分，并避免加入防腐劑。3.16尿液的采集3在動物排尿時，用潔凈的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外陰部或雄畜的陰莖下接取尿液。采取尿液，宜早晨進(jìn)行。3.17環(huán)境為監(jiān)測環(huán)境衛(wèi)生或調(diào)查疾病，可從遺棄物、通風(fēng)管、下水道、孵化廠或屠宰場采集有代表性樣品。4送檢樣品的記錄送往實驗室的樣品應(yīng)有一式三份的送檢報告，一份隨樣品送實驗室，一份隨后寄去，另一份備案。樣品記錄至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）畜主的姓名和畜禽場的地址；b）畜（農(nóng)）場里飼養(yǎng)的動物品種及其數(shù)量；c）被感染的動物種類；d）首發(fā)病例和繼發(fā)病例的日期及造成的損失；e）感染動物在畜群中的分布情況；f）死亡動物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動物數(shù)量及其年齡；g）臨床癥狀及其持續(xù)時間，包括口腔、眼睛和腿部的情況，產(chǎn)奶或產(chǎn)蛋的記錄，死亡情況和時間，免疫和用藥情況等；h）飼養(yǎng)類型和標(biāo)準(zhǔn)，包括飼料種類；i）送檢樣品清單和說明，包括病料的種類、保存方法等；j）動物治療史；k）要求做何種試驗；l）送檢者的姓名、地址、郵編和電話；m）送檢日期。5樣品的運送所采集的樣品以最快最直接的途徑送往實驗室。如果樣品能在采集后24h內(nèi)送抵實驗室，則可放在4℃左右的容器中運送。只有在24h內(nèi)不能將樣品送往實驗室并不致影響檢驗結(jié)果的情況下，才可把樣品冷凍，并以此狀態(tài)運送。根據(jù)試驗需要決定送往實驗室的樣品是否放在保存液中運送。要避免樣品泄漏。裝在試管或廣口瓶中的病料密封后裝在冰瓶中運送，防止試管和容器傾倒。如需寄送，則用帶螺口的瓶子裝樣品，并用膠帶或石蠟封口。將裝樣品的并有識別標(biāo)志的瓶子放到更大的具有堅實外殼的容器內(nèi)，并墊上足夠的緩沖材料。空運時，將其放到飛機(jī)的加壓艙內(nèi)。制成的涂片、觸片、玻片上注名號碼，并另附說明。玻片兩端用細(xì)木條分隔開，層層疊加，底層和最上一片，涂面向內(nèi)，用細(xì)線包扎，再用紙包好，在保證不被壓碎的條件下運送。所有樣品都要貼上詳細(xì)標(biāo)簽。附錄a（規(guī)范性附錄）待檢樣品保存液的配制a.1阿（alserer）氏液葡萄糖2.05g檸檬酸鈉（na3c6h5o7·2h2o）0.80g氯化鈉（nacl）0.42g蒸鎦水（或無離子水）加至100ml溶解后，以10%檸檬酸調(diào)至ph為6.1分裝后，70kpa10min滅菌，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩.230%甘油鹽水緩沖液甘油30ml氯化鈉4.2g磷酸二氫鉀1.0g磷酸氫二鉀3.lg0.02%酚紅1.5ml蒸餾水加至100ml4加熱溶化，校正ph值為7.6，100kpa15min滅菌，冰箱保存?zhèn)溆谩.3肉湯（broth）牛肉膏3.5g蛋白胨10g氯化鈉5g充分混合后，加熱溶解，校正ph為7.2～7.4，再用流通蒸氣加熱30min，用濾紙過濾，獲苗黃色透明液體，分裝于試管或燒瓶中，以100kpa20min滅菌。保存于冰箱中備用。第二篇：食品微生物檢驗采樣方法食品微生物檢驗采樣方法按照上述采樣方案，能采取最小包裝的樣品就采取完整包裝，必須拆包裝取樣的應(yīng)按無菌操作進(jìn)行。不同類型的食品應(yīng)采用不同的工具和方法：1.液體樣品：充分混勻，以無菌操作開啟包裝，用100ml無菌注射器抽取，注入無菌容器。2半固體樣品：以無菌操作拆開包裝，用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。3.固體食品。大塊整體食品應(yīng)用無菌刀具和鑷子從不同部位割取，割取時應(yīng)兼顧表面與深部，注意樣品的代表性;小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。若為檢驗食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。4.冷凍食品。大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采取;大塊冷凍食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從凍塊上舉取樣品，也可以用無菌鉆頭鉆取碎屑狀樣品，放入容器。固體食品和冷凍食品的取樣還應(yīng)注意檢驗?zāi)康模粜铏z驗食品污染情況，可取表層樣品;若需檢驗其品質(zhì)情況，應(yīng)取深部樣品。5.生產(chǎn)工序監(jiān)測（1）車間用水。自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水;湯料等從車間容器不同部位用100ml無菌注射器抽取。（2）車間臺面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測。用5cm2孔無菌采樣板及5支無菌棉簽擦拭25cm2面積。若所采表面干燥，則用無菌稀釋液潤濕棉簽后擦拭;若表面有水，則用干棉簽擦拭，擦拭后立即將棉簽頭用無菌剪刀剪入盛樣容器。（3）車間空氣采樣。直接降塵法。將5個直徑90mm的普通營養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋蓋送檢。第三篇：動物病原微生物實驗室檢驗實習(xí)總結(jié)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實習(xí)總結(jié)專業(yè)動物檢疫年級班級姓名學(xué)號指導(dǎo)教師趙宇軍職稱副教授動物病原微生物實驗室檢驗實習(xí)總結(jié)實習(xí)時間：2012年5月8日至8月13日實習(xí)地點：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實驗室指導(dǎo)老師：趙宇軍實習(xí)內(nèi)容。時間過的很快，轉(zhuǎn)眼間三年的大學(xué)生活就結(jié)束了，我們動物檢疫專業(yè)的同學(xué)從五月份開始了為期3個多月的教學(xué)實習(xí)，在眾多輔導(dǎo)老師之中，我有幸跟隨我校動物科技學(xué)院預(yù)防系的趙宇軍教授進(jìn)行學(xué)習(xí)。實習(xí)地點為我校獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實驗室。實習(xí)內(nèi)容自行選擇。在老師的帶領(lǐng)下我進(jìn)行了大腸桿菌的實驗室檢測和食物中金黃葡萄球菌的檢驗。下面我們來回顧這次實驗。大腸桿菌的實驗室檢測一、培養(yǎng)基配置我們一般用lb液體培養(yǎng)基來擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在lb固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實驗中培養(yǎng)基配置步驟：1.稱量。準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置lb固體培養(yǎng)基時還需加1g瓊脂。2.溶化。加熱熔化，用蒸餾水定容到50ml。配置lb固體培養(yǎng)基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。3.調(diào)ph。用1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)ph至偏堿性。4.滅菌。在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50mllb液體培養(yǎng)基和50mllb固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。5.倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過程是：①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。二、滅菌和消毒1.無菌技術(shù)。①對實驗操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。2.消毒方法。①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；②對一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；④實驗操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3.滅菌方法。①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。三、細(xì)菌的分離采用劃線分離法，其操作步驟是。將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線3～5條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。四、菌落和菌種種類的辨認(rèn)細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。食品中金黃葡萄球菌的檢測方法金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類和動物的皮膚及外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報導(dǎo)，在正常人群中的帶菌率可達(dá)30%~80%，其中皮膚帶菌率為8~22%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上，因此其可通過各種途徑和方式，尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細(xì)菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細(xì)菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費者食物中毒。我國對金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國家標(biāo)準(zhǔn)gb.4789-10-84及檢驗檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)sn.0172-92作為依據(jù)。整個檢測過程獲得最終結(jié)果須時5天左右，既費時又費力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時出運，并使貨主的倉儲成本提高，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。多年來很多食品微生物實驗室都在探索和尋找一些準(zhǔn)確性高，并快速的檢測方法，最近我們分別從美國3m公司和法國生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，其名稱為：①petrifilmrsa.countplate（由美國3m公司研制生產(chǎn)），是一種薄膜型快速檢測金黃色葡萄球菌的計數(shù)平板。②baird-parker+rpfagar.（由法國生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用baird-parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測計數(shù)平板）。一、實驗原理petrifilm.rsa.測試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片，此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的barid-parker，營養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶（tnase）反應(yīng)片，含有dna及甲苯胺蘭（toluidineblue-o）及四唑指示劑（tetraeolium）。此指示劑有助于菌落的計數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。耐熱去氧核糖核酸（deoxyribonulcasdnase）為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100℃加熱30min，不易喪失活性，在130℃之下，其d值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點ph為9.6，耐熱去氧核糖酸與檢測血漿凝固酶相似，是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法，在petrifilm.rsa檢測片上，耐熱dna酶反應(yīng)看起來，呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個紅色或蘭色的菌落。petrifilm.rsa檢測片，必須與peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用，單獨使用將不會顯示菌落，因為具有輔助計數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上，而不是在petrifilm.rsa檢測片上。baird-parker+rpfagar，這一培養(yǎng)基中含有豐富的營養(yǎng)成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，rpf補充有兔血漿和牛纖維蛋白原，以便檢測凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽性菌落周圍沉淀暈環(huán)纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落，即可確認(rèn)，并作計數(shù)。二、實驗步驟材料和方法：本次實驗采用以下3種試劑：1.美國3m公司提供的petrifilm.rapid.s.aureuscountplate.2.法國生物~梅里埃公司提供的baird-parker+rpfagar.3.實驗室自配baird-park瓊脂（英國oxoid）及新鮮兔血漿。菌種來自美國菌種保存中心（americatypculturecollection）。金黃色葡萄球菌共10株菌株，其菌號分別為：atcc27661atcc27664atcc13565atcc51704atcc（k）12600atcc（r）65389atcc25923atcc29213atcc8095atcc12598非金黃色葡萄球菌菌種5株，其菌號分別為：atcc51813（大腸桿菌）、atcc624（無乳鏈球菌）、atcc51816（陰溝腸桿菌）、atcc6051（枯草桿菌）、atcc49214（腸炎沙門氏菌）、自然食品檢樣，任意購自市場。本次實驗是以同一測試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過無菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個稀釋度同時接種上述三種培養(yǎng)基作平行實驗，在取得最終結(jié)果后相互進(jìn)行比對。上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說明進(jìn)行操作，另外baird-parkeragar培養(yǎng)基是按sn0172-92標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。a、本次實驗共測試已知標(biāo)準(zhǔn)菌種共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌種5株（包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無乳鏈球菌）。b、測試自然食品檢樣共101只（其中包括肉11只、肉類14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。三、實驗結(jié)果：a、被檢菌種10株，金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長情況良好，同一稀釋度的菌液，除個別菌株外在3種培養(yǎng)基計數(shù)檢測結(jié)果基本都在一個數(shù)量級上，無顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長。b、自然食品檢樣共接種101只，每一檢樣同一稀釋濃度分別同時種三種培養(yǎng)基，最終共檢出金黃色葡萄球菌45只，占全部檢樣的44.5％，其中petrifilmrsa檢出陽性結(jié)果為42只，占全部陽性檢樣的93.3％，baird-parker＋rpfagar.檢出陽性結(jié)果26只，占全部陽性檢樣的57.7％。baird-parker.agar檢出陽性結(jié)果32只，占全部陽性檢樣的71.1％。四、實驗討論1.用15株標(biāo)準(zhǔn)菌在3種培養(yǎng)基中的檢測，10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種，結(jié)果生長良好，其最終計數(shù)基本一致，定位在同一數(shù)量級，5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長，說明上述三種培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌選擇良好。2.以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液，同時接種三種培養(yǎng)基，從最終結(jié)果來看，對金黃色葡萄球菌的陽性檢出率為44.5％3.從檢測程序來年，petrifilm.rsa及baird-parker＋rpf.agar.都在樣品接種后28~30h觀察結(jié)果，并不必再做證實試驗，而如以baird-parkeragar檢測，須在接種后48h觀察平板，并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營養(yǎng)肉湯中，在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱dna酶試驗進(jìn)行證實，最終計數(shù)，前后約須80h。4.從本次試驗中觀察，使用上述三種培養(yǎng)基對食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計數(shù)檢測，其樣品接種液的含量擬控制在100個/ml以內(nèi)，比較容易分清并計數(shù)，如菌量過濃，則將會影響最后的讀數(shù)，因此對新送的被檢樣品，如在不了解污染的情況下一般必須要做2個以上的稀釋度，同時分別接種，才能獲得較為滿意的結(jié)果。而在baird-parker＋rpfagar及baird-parker.agar接種時必須將1ml樣液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）這樣就會造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大，但baird-parker.rpf.培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng)，并作計數(shù)。5.在整個測試過程中，我們發(fā)現(xiàn)，按使用說明對petrifilm.rsa.及barid-parker＋rpf.agar，操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果，此時往往由于菌落長得經(jīng)較小，特征瓜不明顯，但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯，并可能會經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加，這樣可以提高檢測結(jié)果的可信度。6.由于對上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報價，故無法測算每一樣品的測試成本價格。但可以予計上述兩面種快速檢測培養(yǎng)基的耗材費用要高于常規(guī)經(jīng)典方法（baird-parkeragar）的費用。7.通過本次實驗，我們感到使用美國3m公司生產(chǎn)的petrifilm.rsaplate培養(yǎng)基和法國生物－梅利埃公司生產(chǎn)的baird-parkerrpf.agar培養(yǎng)基檢測中的金黃色葡萄球菌。可以比目前常規(guī)檢測方法時間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實驗室快速檢測的要求，尤其是對基層較簡陋的實驗室條件中，更顯其使用方便的優(yōu)越性。實習(xí)總結(jié)。通過這次嚴(yán)謹(jǐn)而有序的實驗實習(xí)，為我們先前在教學(xué)中學(xué)習(xí)到的知識提供了一個實際的操作實施平臺，也為今后在這方面檢驗技術(shù)的工作起到了指引作用。在過去的學(xué)習(xí)中，我們并不了解具體的病原微生物實驗室檢驗技術(shù)的具體流程，注意事項等等非常關(guān)鍵和必須的防御手段。通過此次生產(chǎn)實習(xí)，使我們對以前所不熟知的問題有了深入的認(rèn)識，也對目前的情況有所思考和感悟。在我看來，動物檢疫人員在我國國民生活中起到了關(guān)鍵作用，民以食為天，沒有認(rèn)真負(fù)責(zé)的實驗檢測，將給社會帶來巨大的飲食災(zāi)難，為此，我感到非常自豪和驕傲。在今后的工作學(xué)習(xí)中，我將一如既往的認(rèn)真下去，無愧自己的職責(zé)和稱號。在此感謝我院的各級領(lǐng)導(dǎo)，特別是我的指導(dǎo)老師趙宇軍教授。第四篇：靖遠(yuǎn)縣動物疫控中心實驗室2012年動物疫病監(jiān)測工作計劃靖遠(yuǎn)縣動物疫控中心實驗室2012年動物疫病監(jiān)測實施方案為及時掌握動物疫病免疫狀況、流行規(guī)律和疫情動態(tài)，增強(qiáng)重大動物疫情預(yù)警預(yù)報能力，根據(jù)市畜牧獸醫(yī)局《2012年白銀市動物疫病監(jiān)測計劃實施方案》要求，現(xiàn)制訂靖遠(yuǎn)縣動物疫病預(yù)防控制中心2012年動物疫病監(jiān)測工作實施方案。一、指導(dǎo)思想全面掌握和分析高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍(lán)耳病、新城疫等主要動物疫病病原分布和流行規(guī)律，評估重大動物疫病免疫效果，及時掌握疫情動態(tài)，消除疫情隱患，發(fā)布預(yù)警預(yù)報，科學(xué)開展防控工作。二、組織與分工（一）疫控中心主任負(fù)責(zé)監(jiān)測工作的全面管理，組織貫徹市局下達(dá)的任務(wù)及監(jiān)測工作中重大事務(wù)的決策；主管實驗室工作的疫控中心副主任負(fù)責(zé)具體工作的安排及各部門的協(xié)調(diào)。（二）鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站1、按照疫控中心分解的任務(wù)保質(zhì)保量及時完成免疫抗體監(jiān)測、病原學(xué)監(jiān)測采樣工作。采集的樣品送疫控中心實驗室檢測。采樣數(shù)量和采樣要求見《采樣分配表》；2、按照要求正確填寫采樣單，認(rèn)真完成“春秋”兩防的信息收集統(tǒng)計工作；3、負(fù)責(zé)及時將動物疫情監(jiān)測報告送達(dá)樣品采集場戶；4、負(fù)責(zé)本鄉(xiāng)鎮(zhèn)動物疫情收集、匯總、上報及重大動物疫情預(yù)報、預(yù)警工作。（三）中心實驗室負(fù)責(zé)具體實施動物疫病的監(jiān)測工作，主要任務(wù)是：1、承擔(dān)全縣主要動物疫病實驗室免疫抗體監(jiān)測工作；2、負(fù)責(zé)全縣主要動物疫病的定點定期監(jiān)測工作，重點是種畜禽場、大型規(guī)模化養(yǎng)殖場；3、負(fù)責(zé)對全縣動物疫病監(jiān)測工作進(jìn)行監(jiān)督指導(dǎo)，協(xié)助各鄉(xiāng)鎮(zhèn)解決在監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的疑難技術(shù)問題；4、進(jìn)場入戶積極開展兩病監(jiān)測和防控工作；5、負(fù)責(zé)在全縣范圍內(nèi)進(jìn)行不定點不定期的隨機(jī)抽樣監(jiān)測工作，以及上級臨時下達(dá)的其他檢測任務(wù)；6、負(fù)責(zé)匯總分析全縣動物疫病監(jiān)測結(jié)果，并按規(guī)定上報；7、負(fù)責(zé)檢驗試劑、耗材等物品的采購供應(yīng)并確保試劑耗材的質(zhì)量、數(shù)量，滿足監(jiān)測工作需要。三、監(jiān)測工作的安排（一）組織實施工作1、擬定于3月份召開的全縣春防工作會議上，安排部署具體的采樣監(jiān)測工作。2、2012年底至2013年初召開全縣動物疫病監(jiān)測工作總結(jié)會。（二）日常監(jiān)測1、縣級定點定期監(jiān)測工作：列入到縣級定點監(jiān)測單位的種畜禽場、大型規(guī)模化養(yǎng)殖場，由中心實驗室按照監(jiān)測方案要求的單位和數(shù)量，在每月15日前完成血清樣品和病原學(xué)檢測樣品的采集工作；2、監(jiān)測時間：中心實驗室在集中免疫結(jié)束后10天內(nèi)完成檢測任務(wù)，包括：高致病性禽流感、口蹄疫、豬瘟、雞新城疫主要動物疫病的日常監(jiān)測工作。5月至6月份開展奶牛兩病篩查工作。（三）緊急監(jiān)測在日常工作中發(fā)現(xiàn)可疑病例，應(yīng)隨時采樣，及時檢測。四、監(jiān)測結(jié)果的報告（一）中心實驗室對全縣的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計、匯總和分析，并將全縣的監(jiān)測結(jié)果上報畜牧獸醫(yī)局，年終報送一次監(jiān)測工作總結(jié)。（二）疫情測報人員每月底前將本月的監(jiān)測結(jié)果上報中國動物疫病預(yù)防控制中心。（三）對監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)疑似重大動物疫病或檢出的兩病陽性結(jié)果的，及時按規(guī)定上報第五篇：動物疫病防治技術(shù)1、試述豬瘟免疫程序答。豬瘟免疫效果的好壞，取決于母源抗體的高低，接種時間，接種劑量和所用疫苗等問題。試驗結(jié)果表明仔豬母源抗體的消長規(guī)律，與母豬免疫時間相關(guān)聯(lián)，即母豬免疫至仔豬產(chǎn)出的時間越短，仔豬母源抗體相對較多，持續(xù)時間長。相反，母豬免疫至仔豬產(chǎn)出的時間越長，所產(chǎn)仔豬的母源抗體相對較少，持續(xù)時間短。要使母豬和仔豬保持相對穩(wěn)定的豬瘟抗體，母豬必須每6個月接種一次豬瘟凍干苗。經(jīng)每6個月接種一次豬瘟凍干苗的母豬所產(chǎn)仔豬，在30日齡左右接種一頭劑豬瘟凍干苗，接種后275天用石門系強(qiáng)毒攻毒獲百分之百保護(hù)，此時絕大多數(shù)肉豬已出欄。據(jù)此豬瘟免疫程序為（1）豬瘟控制區(qū)應(yīng)用經(jīng)產(chǎn)母豬每6個月用豬瘟凍干苗1頭劑接種一次，仔豬30日齡左右用豬瘟凍干苗1頭劑接種一次，種公豬每年春，秋用豬瘟凍干苗1頭劑接種一次。（2）豬瘟非控制區(qū)應(yīng)用經(jīng)產(chǎn)母豬，種公豬每6個月接種一次，仔豬20，65日齡時各接種一次，每次接種豬瘟凍干苗1頭劑。此外還可根據(jù)當(dāng)?shù)貙嶋H，采用哺乳前一次接種。至于腹腔注射，陰道注人，人工授精接種方法，必須接種后3～4個月再行接種一次。2、試述農(nóng)戶散養(yǎng)雞新城疫的免疫答。根據(jù)我國目前國情，養(yǎng)雞業(yè)多以農(nóng)戶養(yǎng)為主，如何將農(nóng)戶散養(yǎng)的雞免疫接種好，使之不發(fā)病或少發(fā)病，是獸醫(yī)工作者必須考慮的問題。首先要選用有效疫苗新城疫叭苗具有耐熱性（38℃保存45天能存活），同居感染免疫性，穩(wěn)定性，免疫期較長等優(yōu)點。新城疫工系苗屬中等毒力疫苗，免疫期長。這三種疫苗聯(lián)合運用，適合于農(nóng)戶散養(yǎng)雞新城疫的免疫。其次要采用科學(xué)的接種方法7～10日齡雛雞，先停水，將新城疫v4苗按每只2羽份，用適量涼開水稀釋，讓雞自飲。飲完后，停水，再將新城疫v4苗按每只2羽份，用適量涼開水稀釋，讓雞自飲。120～125日齡雞用新城疫工系苗肌肉注射，每只1羽份。第三是接種方式利用新城疫v4苗耐熱的特點，農(nóng)戶可在鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)防疫站購苗，自行給雞飲水免疫接種，以及每年春秋由鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)防疫站進(jìn)行新城疫工系苗肌肉注射免疫接種。雖然上述新城疫免疫程序不如集約化雞場的免疫接種科學(xué)，但就目前農(nóng)戶散養(yǎng)雞來說，其方法實用，有效，可行。3、試述良種肉鴨主要疾病的綜合防治答。良種肉鴨生長周期性短，一般在25～30天即可育肥出欄，加之多數(shù)是集約化飼養(yǎng)，疫病流行非常快，死亡多，經(jīng)濟(jì)損失大，所以對良種肉鴨的疾病防治應(yīng)有足夠認(rèn)識。經(jīng)調(diào)查良種肉鴨的主要疾病有病毒性傳染性肝炎，漿膜炎，副傷寒，大腸桿菌病，巴氏桿菌病，鴨瘟等。根據(jù)這些疾病發(fā)生時間不同，主要防治技術(shù)有以下幾項。（1）消毒技術(shù)育雛室，育成室和所用器具的消毒。（2）育雛室內(nèi)的保溫技術(shù)（冬天應(yīng)升溫至35℃左右）。（3）副傷寒的防治技術(shù)可采用廣譜抗生素飲水或注射。（4）病毒性傳染性肝炎的防治技術(shù)7～9日齡時皮下注射抗肝炎高免血清，一般不用肝炎疫苗注射。（5）漿膜炎的防治技術(shù)肉鴨在10，15，20日齡時用廣譜抗菌素注射。同時防治巴氏桿菌病和大腸桿菌病。（6）鴨瘟病的防治技術(shù)根據(jù)鴨瘟多發(fā)生于成鴨，一月齡以內(nèi)的鴨發(fā)病少的原則，良種肉鴨的鴨瘟防治，采取發(fā)病后立即用鴨瘟疫苗進(jìn)行緊急預(yù)防接種的措施，效果好。4、試述仔豬主要疾病的綜合防治答。仔豬（（60日齡內(nèi)的小豬）培育期間的主要疾病包括仔豬黃痢，白痢，缺鐵性貧血，豬瘟，仔豬副傷寒，寄生蟲等。針對這些疾病的發(fā)生時間和危害程度，特提出以下綜合防治措施。（1）母豬在配種前30天左右接種豬瘟凍干苗，旨在確保母豬對豬瘟病的免疫和具有足夠母源抗體傳遞給仔豬，使仔豬在30日齡內(nèi)不患豬瘟病。（2）懷孕母豬的產(chǎn)仔前10～20天接種大腸桿菌k88，k99雙價基因工程苗，仔豬通過吃乳獲得抵抗黃痢，白痢的抗體，使之不患黃痢，白痢病。（3）仔豬出生前三天對母豬圈舍，墊草，仔豬欄等要徹底消毒。（4）仔豬的早期護(hù)理，其中主要內(nèi)容要讓每頭仔豬都能吃足初乳，提高抗病力。（5）仔豬出生后3日齡內(nèi)用右旋糖酐鐵進(jìn)行注射補鐵。（6）仔豬出生后第二天開始口服生物活菌制，調(diào)整仔豬胃腸道的微生態(tài)平衡，預(yù)防黃，白痢的發(fā)生。（7）仔豬在30日齡左右接種豬瘟凍干苗。（8）仔豬在35日齡進(jìn)行仔豬副傷寒菌苗的接種。（9）仔豬40日齡進(jìn)行驅(qū)