高考一輪微生物的培養與應用第一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二專題2微生物的培養與應用第四十四課時課題1～3微生物的實驗培養、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數、分解纖維素的微生物的分離第二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1．微生物的分離和培養2.培養基對微生物的選擇作用3.利用微生物進行發酵來生產特定的產物第三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二營養物質定義作用主要來源碳源凡能提供所需碳元素的物質構成生物體的細胞物質和一些代謝產物，有些是異養生物的能源物質無機化合物(CO2、NaHCO3)，有機化合物(糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等)氮源凡能提供所需氮元素的物質合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物無機化合物(N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽)，有機化合物(尿素、牛肉膏、蛋白胨等)生長因子生長必不可少的微量有機物酶和核酸的組成成分維生素、氨基酸、堿基等1．微生物的營養物質及功能

微生物的營養物質主要有碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水這五大類。考點一培養基第四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二(1)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源。自養微生物利用CO2或碳酸鹽作為碳源（以無機碳源作為主要碳源）。而異養微生物的碳源是有機物，最常利用的是糖類(特別是葡萄糖)；(2)微生物最常利用的氮源是氨鹽、硝酸鹽。能把氮氣作為氮源的只限于固氮菌、某些放線菌和藻類等。霉菌僅以無機氮素化合物為氮源；部分細菌不用有機氮化合物作為氮源就不能生長。(3)微生物之所以需要補充生長因子，是由于缺乏合成這些物質所需要的酶或合成能力有限。

拓展提升各類微生物的營養物質的主要來源第五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二幾種常見微生物的營養能量來源微生物類型碳源氮源能源大腸桿菌硝化細菌根瘤菌固氮藍藻拓展提升糖類、蛋白質等有機物蛋白質等有機物CO2NH3NH3糖類等有機物N2有機物CO2N2光能第六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二培養乳酸菌——添加維生素培養霉菌——PH調至酸性培養細菌——PH調至中性或微堿性培養厭氧微生物——無氧環境【特殊要求】第七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二劃分標準培養基種類特點用途物理性質化學成分天然培養基含化學成分不明 確的天然物質工業生產合成培養基

培養基成分明確(用化學成分己知的化學物質配成)分類、鑒定2．培養基的種類液體培養基半固體培養基固體培養基不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業生產、增菌觀察微生物的運動、 分類、鑒定微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種第八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二劃分標準培養基種類特點用途用途培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長培養、分離出特定微生物根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅—美藍培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤)選擇培養基鑒別培養基第九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二培養基應用加入青霉素加入高濃度食鹽不加氮源不加含碳有機物的無碳培養基拓展提升幾種常見的選擇培養基分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養型微生物第十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【回扣教材】考點一培養基1．培養基的定義：人們按照微生物對

的不同需求，配制出供其

的營養物質。營養物質生長繁殖2．類型：培養基按照

可分為液體培養基和固體培養基。在液體培養基中加入凝固劑

后，制成瓊脂固體培養基，是實驗室最常用的培養基之一。微生物在固體培養基表面生長，可以形成

的_。物理性質瓊脂肉眼可見菌落第十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二3．營養物質：各種培養基一般都含有水、____源、____源和無機鹽四種營養物質。滿足微生物生長還需要適宜的____(培養霉菌時需要將培養基的pH調至酸性，培養細菌時需將pH調至

或

性)、氧氣的要求(根據微生物的需求提供有氧或無氧環境)、

物質(如培養乳酸桿菌時需要在培養基中添加

等)。碳氮中性微堿特殊營養維生素pH第十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【典例精析】【例1】大腸桿菌能夠在哪種培養基上生長繁殖()A．無氮培養基B．分解尿素的細菌的選擇培養基C．纖維素分解菌的選擇培養基D．牛肉膏蛋白胨培養基【解析】大腸桿菌為異養微生物，以糖類、蛋白質等有機物作為碳源，以蛋白質等作為氮源。D第十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、無菌技術的概念

無菌操作泛指在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。考點二無菌技術2、無菌技術的主要內容實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗操作過程(酒精燈旁操作)第十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二項目消毒滅菌條件使用較為溫和的理化方法使用強烈的理化因素結果殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子適用范圍實驗操作的空間、操作者的衣著和手微生物的培養器皿、接種用具和培養基等常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥劑消毒法、紫外線消毒法灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌2．消毒與滅菌的比較第十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用70%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒消毒的方法拓展提升第十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.滅菌的方法拓展提升第十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二(1)高溫加熱滅菌原理：使細菌體內蛋白質變性，從而達到殺滅細菌的目的。

(2)化學藥劑消毒原理：使細菌體內蛋白質變性，但是化學物質很難透過孢子或芽孢的堅硬外層進入細胞內，因此化學方法難以消滅孢子和芽孢。

(3)體積分數為70%的乙醇殺菌效果最好的原因：濃度過低，殺菌力弱；濃度過高，使菌體表面蛋白質凝固形成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其內，影響殺菌效果。對剛洗刷后未干的器皿，可選擇75%的酒精進行消毒。拓展提升第十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二培養基培養皿空氣接種環雙手牛奶②巴氏消毒③化學消毒⑤紫外線消毒⑥高壓蒸氣滅菌①灼燒滅菌④干熱滅菌常用的消毒方法和滅菌方法對點訓練第十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二考點二無菌技術【回扣教材】獲得純凈培養物的關鍵是防止外來________的入侵，要注意以下幾個方面：(1)對實驗操作的_______、操作者的______和______進行_______和________。(2)將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等器具進行________。(3)為避免周圍環境中微生物的污染，____________應在酒精燈____________進行。(4)實驗操作時應避免___________處理的材料用具與_________的物品相接觸。雜菌空間衣著手清潔消毒滅菌實驗操作火焰附近已經滅菌周圍第二十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【典例精析】【例2】關于滅菌和消毒的下列說法不正確的是()A．滅菌是指殺死環境中的所有微生物，包括芽孢和孢子B．滅菌和消毒實質上是相同的C．接種環用灼燒法滅菌D．常用的滅菌方法有加熱法、過濾法、紫外線法、化學藥品法B第二十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二微生物實驗室培養的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養基的配制3、培養基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養7、菌種的保存考點三純化大腸桿菌和菌種的保藏第二十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、培養基的配制流程(以牛肉膏蛋白胨培養基為例)①計算：根據牛肉膏蛋白胨培養基配方的比例，計算配制100mL的培養基時，各種成分的用量。②稱量：準確地稱取各種成分。一、大腸桿菌的純化培養包括培養基的配制和純化大腸桿菌兩個階段。第二十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二③溶化：先將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯，加入少量的水加熱。當牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。然后往燒杯中加入蛋白胨和氯化鈉，最后加入瓊脂，加熱使其熔化。在此過程中不斷用玻璃棒攪拌，防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。當瓊脂完全熔化后，補加蒸餾水至100mL。第二十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二④滅菌：將配制好的培養基轉移到錐形瓶中加棉塞包好，放入高壓滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃條件下，滅菌15～30min將培養皿包好后放入干熱滅菌箱內，在160～170℃下滅菌2h。⑤倒平板：等培養基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。第二十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二倒平板技術第二十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二問題1：培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？答：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。問題2：為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。問題探討第二十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二問題3：平板冷凝后，為什么要將平板倒置？問題4：在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。問題探討第二十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二2、純化大腸桿菌（1）接種：①平板劃線法:通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續畫線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面.在數次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落。（包括大腸桿菌的接種和培養過程）第二十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第三十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二問題1：為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。問題探討第三十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二問題2：在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。問題3：在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。問題探討第三十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落。第四十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第四十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第四十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二問題：涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？答：應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。問題探討第四十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二(2)培養：將接種后的培養基和一個未接種的培養基(對照組)都放入37℃恒溫箱中，培養12h和24h后，分別觀察并記錄結果。第四十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌純化培養的課題成果評價

（一）培養基的制作是否合格如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發現這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養學生良好的科學態度與習慣。第四十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二二、菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法第四十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二考點三純化大腸桿菌以及菌種的保藏【回扣教材】1．制作牛肉膏蛋白胨固體培養基(1)方法步驟：_______、稱量、溶化、__________、_________。(2)倒平板操作的步驟：計算滅菌倒平板第四十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二①將滅過菌的培養皿放在_________的桌面上，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿錐形瓶，將_______迅速通過火焰。③用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養基(約10～20mL)倒入培養皿，左手立即蓋上培養皿的皿蓋。④等待平板___________，大約需5～10min。然后，將平板倒過來放置，使培養皿蓋在下、皿底在上。火焰旁瓶口冷卻凝固第四十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二2．純化大腸桿菌(1)微生物接種的方法最常用的是___________法和_______________法。(2)平板劃線法是通過________在瓊脂固體培養基表面__________的操作。(3)稀釋涂布平板法是將_______進行一系列的______稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到_______培養基的表面，進行培養。分為_______________和______________兩步。(4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物_______成單個_______，從而能在培養基_______形成單個的________。平板劃線稀釋涂布平板接種環連續劃線菌液梯度瓊脂固體系列稀釋操作涂布平板操作分散細胞表面菌落第四十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

(5)平板劃線法操作步驟：①將接種環放在火焰上_______，直到接種環_______。②在火焰旁________接種環，并打開盛有菌液的試管的棉塞。③將_________通過火焰。④將_________的接種環伸入菌液中蘸取一環菌液。⑤將_________通過火焰，并塞上棉塞。灼燒燒紅冷卻試管口已冷卻試管口第五十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條__________，蓋上皿蓋。注意不要劃破__________。⑦灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的________開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意________將最后一區的劃線與第一區相連。⑧將平板________放入培養箱中培養。平行線培養基末端不要倒置第五十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

(6)涂布平板操作的步驟：①將_______浸在盛有酒精的燒杯中。②取_______菌液(不超過0.1mL)，滴加到培養基表面。③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上________，待酒精_______后，________8～10s。④用涂布器將菌液________地涂布在培養基表面。涂布器少量引燃燃盡冷卻均勻第五十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二3．菌種的保存(1)對于頻繁使用的菌種，可以采用______保藏的方法。①臨時保藏方法將菌種接種到試管的固體___________上，在_______的溫度下培養。當菌落長成后，將試管放入______的冰箱中保藏。以后每________個月，都要重新將菌種從舊的培養基上________到新鮮的培養基上。②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易_______或產生________。

臨時斜面培養基合適4℃3～6轉移被污染變異第五十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二(2)對于需要_______保存的菌種，可以采用________管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后_______。將1mL培養的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在_________的冷凍箱中保存。長期甘油滅菌－20℃第五十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第五十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

(1)實驗過程中對培養基、培養皿、實驗操作者的雙手所采用的滅菌、消毒方法依次是__________________、________________、______________。(2)培養大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養基是否被污染。對于固體培養基應采用的檢測方法是______________________________________________________________________________________________。(3)圖示是利用________法進行微生物接種，把聚集的菌種逐步_________分散到培養基的表面。在灼燒接種環之后，要等其冷卻后再進行劃線的原因是____________________________。高壓蒸汽滅菌干熱滅菌化學消毒將未接種的培養基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察培養基上是否有菌落產生平板劃線稀釋以免接種環溫度太高，殺死菌種第五十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

(4)關于圖示的操作方法和結果，敘述正確的是____。A．操作前要將接種環放在火焰邊灼燒滅菌B．劃線操作須在火焰上進行C．在5區域中才可以得到所需菌落D．在1、2、3、4、5區域中劃線前后都要對接種環滅菌(5)若要培養具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌，制備選擇培養基時在基本培養基的基礎上，注意__________________________和_________，其目的是__________________________。【解析】本題考查了微生物培養等知識，滅菌、接種等操作方法。D添加高濃度蔗糖(葡萄糖)調低pH提供高糖和酸性的篩選環境第五十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【例4】關于大腸桿菌的敘述，正確的是()A．四環素能抑制細胞中蛋白質的合成B．經誘變育種可獲得人胰島素高產菌株C．細胞中只含有A、T、C、G四種堿基D．T2噬菌體感染菌體，不會導致菌體裂解【解析】四環素通過抑制細菌蛋白質的合成從而抑制細菌繁殖，A正確；要想獲得能產生人胰島素的高產菌株，只有通過基因工程來實現，B不正確；大腸桿菌細胞中含有DNA和RNA兩種核酸，含有A、G、C、T、U五種堿基，C不正確；T2噬菌體感染菌體后，在菌體內大量增殖，則會使菌體裂解，子代噬菌體釋放出來，D不正確。A第五十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

1、自然界篩選：PCR技術啟示：尋找目的菌種時要根據它對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數微生物只有Taq細菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制(PCR)的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。一、篩選菌株考點四篩選菌株、統計菌落數目、設置對照第五十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二要分離一種微生物，必須根據該微生物的特點，制作選擇培養基；2、實驗室中篩選：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。實例：此培養基就能夠選擇出分解尿素的微生物。第六十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、顯微鏡直接計數：利用血球計數板(血細胞計數板），在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。二、統計菌落數目不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點：第六十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二2.間接計數法（活菌計數法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。第六十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二某同學在稀釋倍數為106

的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每克樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B對點訓練第六十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30——300的平板上進行計數。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經涂布，培養計算出菌落平均數。③統計的菌落往往比活菌的實際數目低。(3)注意事項第六十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二說明設置重復組的重要性。在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結果時，一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。三、設置對照第六十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二判斷培養基中是否有雜菌污染：將未接種的培養基同時進行培養。判斷選擇培養基是否具有篩選作用：完全培養基（營養成分齊全）接種后培養觀察菌落數目。主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。設置對照的作用：第六十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統計菌落數目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同⑵培養基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)如何設置對照：第六十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養，作為空白對照，以證明培養基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養基的配制有問題。第六十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二考點四篩選菌株、統計菌落數目、設置對照【回扣教材】1．篩選菌株(1)自然界篩選：實例：DNA多聚酶鏈式反應(PCR)要求使用____________________________酶。科學家從水生耐熱細菌Taq中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶。耐高溫的DNA聚合第六十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二方法：根據目的菌對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。(2)實驗室中篩選：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括_______、_______、______等)，同時_______或_______其他微生物生長。(3)選擇培養基在微生物學中，將允許_______種類的微生物生長，同時抑制或阻止_________微生物生長的培養基，稱作_________培養基。營養溫度pH抑制阻止特定其他種類選擇第七十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二2．統計菌落數目測定微生物數量的常用方法有________________法和____________________法。3．設置對照(1)設置對照的主要目的是排除__________中_______________對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。(2)判斷培養基中是否有雜菌污染：___________________________________________。(3)判斷選擇培養基是否具有篩選作用：____________________________________________。稀釋涂布平板顯微鏡直接計數實驗組非測試因素將未接種的培養基在相同的條件下進行培養對照培養基(營養物質齊全)接種后培養觀察菌落數目第七十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【典例精析】【例5】自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將它們分離提純，然后進行數量的測定。下面是對大腸桿菌進行數量測定的實驗，請回答有關問題。實驗步驟：(1)制備稀釋倍數為102、103、104、105、106的系列稀釋液。(2)為了得到更加準確的結果，你選用______________法接種樣品。(3)適宜溫度下培養。稀釋涂布平板第七十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二結果分析：(1)測定大腸桿菌數時，在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確可信的是______，其理由是______________________________________________________________________________________________________________________________________________。A．一個平板，統計的菌落數是230B．兩個平板，統計的菌落數是220和260，取平均值240C．三個平板，統計的菌落數分別是210、50和520，取平均值260D．四個平板，統計的菌落數分別是210、300、240和250，取平均值250D在設計實驗時，一定要涂布至少三個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性；在分析實驗結果時，要考慮所設置的重復組的結果是否合理第七十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

(2)一同學在稀釋倍數為105的培養基中測得平板上菌落數的平均值為234，那么每毫升樣品中的菌落數是___________(涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)。(3)用這種方法測定的大腸桿菌密度，實際活菌數量要比測得的數量______，因為______________________________________________________________________________________________。【解析】(2)每毫升樣品中的菌落數＝234×105÷0.1＝2.34×108。2.34×108多當兩個或多個細菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落第七十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、尿素的利用尿素是一種重要的農業氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌能利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3考點五土壤中分解尿素的細菌的分離與計數一、課題基礎第七十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌第七十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO45、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數所需培養基：①從物理性質看此培養基屬于哪類？固體培養基②在此培養基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素第七十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二怎樣證明此培養基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養基牛肉膏蛋白胨培養基

是分離尿素細菌判斷該培養基有無選擇性實驗組對照組培養基類型是否接種

目的

結果只生長尿素細菌生長多種微生物是第七十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。“微生物的天然培養基”[一]土壤取樣數量最大、種類最多大約70%—90%是細菌◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。二、實驗設計第七十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二[二]制備培養基

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數為103～107。

準備牛肉膏蛋白胨培養基和選擇培養基。每個稀釋度下需要3個選擇培養基，1個牛肉膏蛋白胨培養基。還需要8個滅菌試管和1個滅菌移液管。

將稀釋相同倍數的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養基上生長的菌落數目應明顯多于選擇培養基上的數目，因此，牛肉膏蛋白胨培養基可以作為對照，用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用。第八十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二◆應在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板（三） 樣品的稀釋第八十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。第八十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養皿作好標記。注明培養基類型、培養時間、稀釋度、培養物等。◆如果得到了2個或2個以上菌落數目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數，如果同一稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第八十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二㈤.微生物的培養與觀察在菌落計數時，每隔24h統計一次菌落數目。選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。培養不同微生物往往需要不同培養溫度。細菌：30～37℃培養1～2d放線菌：25～28℃培養5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養3～4d。第八十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二微生物的培養與觀察第八十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養基種類、培養日期、平板培養樣品的稀釋度等。[三]規劃時間二、操作提示第八十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二四.結果分析與評價1.通過對照實驗，若培養物有雜菌污染，菌落數偏高；若培養物混入其他氮源，則菌落形態多樣，菌落數偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數最合適。同一稀釋倍數的三個重復的菌落數不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。第八十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1.在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。2.測定飲水中大腸桿菌數量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅-美藍培養基上培養，大腸桿菌菌落呈現黑色，通過記算得出水樣中大腸桿菌的數量。五.課外延伸第八十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第八十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌呈深紫色,中心有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

第九十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二考點五土壤中分解尿素的細菌的分離與計數【回扣教材】1．實驗設計實驗設計包括________，所需_______、_______、_____________，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。實驗方案儀器材料用具和藥品第九十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二2．操作提示(1)無菌操作①取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在________都需要滅菌。②應在________稱取土壤。在_______附近將稱好的土樣______錐形瓶中，塞好棉塞。③在______土壤溶液的過程中，每一步都要在________操作。(2)做好標記本實驗使用的平板和試管比較多。為避免混淆，最好在________就做好________。例如，在標記培養皿時應注明____________、_________以及平板上培養樣品的________等。使用前火焰旁火焰倒入稀釋火焰旁使用前標記培養基種類培養日期稀釋度第九十二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二3．課題延伸本課題對能分解尿素的細菌進行了初步的篩選。對分離純化的菌種作進一步的鑒定，還需要借助_________的方法。在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的_______將尿素分解成了______，pH______，以尿素為唯一氮源的培養基加入____________，如果pH升高，____________，可以初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。生物化學脲酶氨升高酚紅指示劑指示劑變紅第九十三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【典例精析】

【例6】尿素是一種高濃度氮肥且長期施用沒有不良影響，但尿素只有通過土壤中某些細菌分解為氨后，才能被植物吸收利用。分解尿素的細菌都能合成脲酶，脲酶能催化尿素水解。某同學要分離土壤中能分解尿素的細菌，并統計每克土壤樣品中活菌數目，培養基配方如下：第九十四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二第九十五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二(1)根據培養基的成分判斷，該同學能否分離出土壤中分解尿素的細菌？______(能/不能)，原因是_______________________________________________________________。(2)要統計每克土壤樣品中活菌數目，宜采用______________法接種，根據土壤樣品的稀釋倍數和接種稀釋液的體積，統計平板上的_________就能大約推測出樣品中活菌數。【解析】本題考查微生物的選擇性培養，以及微生物計數。不能培養基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能選擇出只以尿素為氮源的微生物稀釋涂布平板菌落數目第九十六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1.纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質。考點六分解纖維素的微生物的分離一、基礎知識第九十七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

土壤中某些微生物能夠產生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。第九十八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二2.纖維素酶

纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素第九十九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

在2支20mL的試管中，分別放入1×6cm的濾紙條，再分別加入pH為4.8、物質的量濃度為0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液10mL、11mL。在加入10mL緩沖液的試管中加入1mL纖維素酶（70~80U/mL）。將二支試管固定在50mL的錐形瓶中，在搖床上以140r/min的轉速振蕩反應1h，觀察結果。1U表示1個酶活力單位，是指在溫度為25℃，其他反應條件，如pH等，均為最適的情況下，在1min內轉化1mmol的底物所需的酶量。小實驗：體驗纖維素酶的作用第一百頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；實驗分析：P27的小實驗是如何構成對照的？濾紙崩潰法第一百零一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二3.纖維素分解菌的篩選①篩選纖維素分解菌的方法______________。該方法可以通過________反應直接篩選。剛果紅染色法顏色其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當纖維素被_________分解后，紅色復合物無法形成，出現以_____________為中心的________，可以通過___________________________來篩選纖維素分解菌。紅色復合物纖維素酶纖維素分解菌透明圈是否產生透明圈第一百零二頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二可根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌第一百零三頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二二、實驗設計土壤取樣選擇培養梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養基挑選菌落什么樣的環境取樣?①培養的目的?②選擇培養基的特點?挑選什么樣的菌落?①鑒別培養基的特點?②如何鑒別?根據：微生物對生存環境的要求，到相應環境中去找；目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物；剛果紅染色法第一百零四頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二1、纖維素分解菌選擇培養基屬于______（固體、液體）培養基，原因是_____

【資料二】選擇培養閱讀資料二“選擇培養基”，回答以下幾問題：液體沒有添加瓊脂2、該培養基對微生物_____（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機制是____________________________________________________________________________

具有以纖維素粉為唯一碳源，能分解纖維素的微生物可以大量繁殖；第一百零五頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二若設置一個對照實驗說明選擇培養的作用，應控制的變量是將__________改為_________。3、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養基的作用？葡萄糖纖維素粉第一百零六頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二【資料三】剛果紅染色法方法一：先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應方法二：在倒平板時就加入剛果紅第一百零七頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二培養基組成提供的主要營養物質CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養基(水溶性羧甲基纖維素鈉)第一百零八頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二染色法優點缺點方法一

方法二

顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣，剛果紅會使菌落之間發生混雜操作簡便，不存在菌落混雜問題

產生淀粉酶的微生物也產生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。思考：這兩種方法各有哪些優點與不足第一百零九頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二挑選產生透明圈的菌落

挑取產生明顯的透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。接種到纖維素分解菌的選擇培養基上，在300C－370C培養，可獲得純培養。第一百一十頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

培養基的制作是否合格以及選擇培養基是否篩選出菌落？

對照的培養基在培養過程中沒有菌落生長則說明培養基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

三、結果分析與評價第一百一十一頁，共一百二十頁，編輯于2023年，星期二

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行_____________實驗，纖維素酶的發酵方法有______發酵和______發酵