第三單元免疫凝集類實驗第一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一驗證實驗一直接凝集實驗第二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一顆粒性抗原與相應抗體直接反應，在適當電解質參與下出現的肉眼可見的凝集現象。常用的試驗方法有玻片凝集法和試管凝集法。本實驗以試管法凝集試驗——肥大試驗（Widaltest）驗證凝集反應及其特點。第三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

Widaltest原理

將已知的顆粒性抗原（傷寒沙門菌）定量加入到系列倍比稀釋的待測血清中，根據各血清稀釋度凝集情況，測定血清中有無相應抗體及其相對含量。第四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗器材和材料器械

試管、吸管、恒溫水浴箱等試劑

抗體待測傷寒沙門菌免疫血清、抗原傷寒沙門菌診斷菌液（7×108/ml)、生理鹽水第五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗方法（Widaltest）

取試管7支，依次編號并做好標記。每支試管中加生理鹽水0.5ml。倍比稀釋血清：

取1∶20稀釋的待測血清0.5ml加入到第1管，混勻后吸取0.5ml加入到第2管，如此連續稀釋至第6管，混勻后吸取0.5ml棄去；第7管不加血清作為陰性對照。

加診斷菌液：

每管加傷寒沙門菌H或O診斷菌液0.5ml，此時各管血清最終稀釋度依次為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560搖勻后置37℃水浴2～4h，取出觀察結果或放室溫過夜，次日觀察結果。第六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一試管凝集法操作程序試管號1234567生理鹽水（ml)0.50.50.50.50.50.50.5待測血清（ml)0.50.50.50.50.50.5傷寒O菌液(ml)0.50.50.50.50.50.50.5血清稀釋度1:801:1601:3201:6401:12801:2560第七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一0.50.50.50.50.5棄掉0.5結果

1234567菌液試管凝集試驗原理第八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

結果判斷實驗結果 將試管置于有良好光源和黑色背景下，觀察管底凝集物的范圍和上清液的濁度，記錄凝集程度，判斷凝集效價用++++、+++、++、+、-等符號記錄凝集效價。對照管：應無凝集現象試驗管：“++++”：上清液澄清，細菌全部凝集，凝集塊全部沉于管底

“+++”：上清液稍混濁，細菌大部分凝集并沉于管底

“++”：上清液較混濁，約50%的細菌凝集并沉于管底

“+”：上清液混濁，僅少量細菌凝集

“-”：不凝集，液體濁度與對照管相同血清抗體效價：試驗管出現“++”以上的凝集現象即可判斷為陽性；以出現“++”凝集的最高血清稀釋度為該待測血清的抗體效價。第九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一注意事項凝集反應只有在抗原抗體比例適當時，才能出現肉眼可見的反應一般情況下，隨著血清濃度的逐漸稀釋，凝集反應越來越弱，但在抗體濃度過高時，反而無凝集現象出現，此為前帶現象，出現該情況時，須加大抗體稀釋倍數重新試驗。直接凝集試驗也可以用玻片法以鑒定傷寒沙門菌為例：取潔凈載玻片2張，在玻片的左上角分別標明“1”、“2”；加入已知抗體（傷寒沙門菌診斷血清）和待測菌液（傷寒沙門菌或其他細菌）。1生理鹽水

+傷寒桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學清

+

傷寒桿菌2生理鹽水

+大腸桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學清

+

大腸桿菌玻片凝集試驗鑒定傷寒沙門菌第十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一玻片凝集試驗(slideagglutinationtest)顆粒性抗原與相應抗體直接結合

出現肉眼可見的凝集現象

在玻片上YYY+？Y+第十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一將載玻片置黑色背景上觀察。在診斷血清中，混懸液由混濁變澄清并出凝集物，則為陽性結果；混懸液仍為勻混濁的乳狀液，則為陰性結果。肉眼觀察不夠清晰者，可在低倍鏡下觀察。

結果分析第十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗討論肥大試驗是一種經典的半定量試管凝集試驗。在臨床上主要用已知的傷寒沙門菌O或H抗原檢測血清中有無相應的特異性抗體及其效價，以協助診斷傷寒病或供流行病學調查。凝集反應只有在抗原抗體比例適當時，才能出現肉眼可見的凝集現象。臨床上開展的外斐反應是利用與立克次體有共同耐熱性多糖抗原的變形桿菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次體作為已知抗原，與患者血清進行凝集試驗，以輔助診斷斑疹傷寒、恙蟲病等立克次體疾病。現有OX19、OX2、OXk三種診斷菌液和待測血清，請寫出利用試管凝集法進行的外斐試驗的操作步驟。第十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一思考題為什么臨床上不直接利用立克次體作為已知抗原進行血清學診斷呢？

第十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一驗證實驗二間接凝集實驗

第十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一間接凝集實驗（indirectAgglutinationTest)

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關、大小均勻的惰性載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后再與相應抗體（或抗原）結合，在適當電解質存在的條件下，載體顆粒被動地發生凝集，出現肉眼可見的凝集現象。

以膠乳凝集試驗檢測類風濕因子（rheumatoidfactor,RF）為例驗證間接凝集實驗的原理和特點第十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

實驗原理

類風濕因子（RF）是一種抗變性IgG的自身抗體，具有與人或動物變性IgG結合的特點。將處理過的人IgG與聚苯乙烯膠乳顆粒結合成致敏顆粒，當待測血清中含有RF時，則與致敏顆粒上變性的IgG發生反應，出現凝集現象。第十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一膠乳顆粒人IgG致敏致敏膠乳NS凝集顆粒待測RF第十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗器材

器械 黑色方格反應板、毛細滴管、試管、試管架、吸耳球、恒溫水浴箱等試劑 人IgG致敏膠乳試劑（市售類風濕因子檢測試劑） 類風濕因子陽性血清和陰性血清：臨床標本篩選獲得

待測血清第十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

實驗方法

待測血清、陽性血清、陰性血清分別用生理鹽水作1∶20稀釋。在黑色方格反應板上取3個格，用毛細滴管分別滴加稀釋待測血清、陽性血清、陰性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏膠乳試劑1滴。連續輕輕搖動反應板，2～3分鐘后觀察結果。第二十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一結果判斷

若膠乳顆粒凝集且液體澄清者為陽性反應膠乳顆粒不凝集仍保持均勻膠乳狀者為陰性反應第二十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一注意事項試劑應4℃保存，嚴禁凍結，用時搖勻；所有試驗器皿和反應板均應洗凈、干燥；若陰性對照出現凝集，則表示致敏乳膠試劑有質量問題，不能使用。第二十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗結果分析和討論膠乳凝集試驗方法簡便、快速，但易發生非特異性凝集反應，試分析如何判定實驗的非特異性凝集反應。判斷凝集或凝集程度除目測外，是否還有其他方法？第二十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一驗證實驗三間接凝集抑制實驗第二十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一概念間接凝集抑制試驗（indirectagglutinationinhibitiontest）是以抗原致敏的載體及相應抗體作為診斷試劑，用于檢測標本中是否含有與致敏抗原相同的抗原的試驗。檢測時先將抗體試劑與待測標本混合，再加入抗原致敏的載體。若標本中沒有與抗體試劑相對應的抗原，則抗體試劑與隨后加入的致敏載體上的抗原結合而出現凝集；若標本中存在與抗體試劑相對應的抗原，抗體先與之結合，隨后加入的致敏載體上的抗原則無抗體結合，凝集反應被抑制。本實驗以檢測尿絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫診斷試驗為例進行膠乳凝集抑制現象的觀察和驗證。第二十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗原理

孕婦尿液中含有HCG，正常人尿中無HCG。當向孕婦尿中加入一定量抗HCG抗體時，尿HCG即與抗HCG發生抗原抗體反應，此時，再加入膠乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯膠乳顆粒），因抗體被消耗，故不能發生凝集，即凝集被抑制，為凝集抑制試驗陽性；反之，若待檢尿中無HCG（非妊娠尿），則加入的抗HCG抗體未被結合和消耗，可與隨后加入的乳膠抗原發生反應，出現肉眼可見的細小顆粒，即凝集未被抑制，為凝集抑制試驗陰性。第二十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一待測尿液(含HCG)抗HCG特異結合抗原抗體復合物NS＋致敏膠乳無凝集顆粒為陽性第二十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一待測尿液(無HCG)抗HCG無結合NS＋致敏膠乳有凝集顆粒為陰性第二十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗器材和材料器械 黑色方格反應板、毛細滴管試劑與標本膠乳抗原（HCG致敏的膠乳顆粒）、抗HCG抗體（商品化）孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液。生理鹽水第二十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗方法在黑色方格反應板上取3個格，用毛細滴管分別加待測尿液、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，輕輕搖動1～2min。于上述3格中各滴加膠乳抗原1滴，輕輕搖動2～3min后觀察結果。第三十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一結果判斷如肉眼觀察結果不清楚，可用顯微鏡在低倍鏡下觀察樣本待測尿液孕婦尿液正常人尿(或NS)現象凝集或不凝集不凝集凝集結果判定非妊娠尿或妊娠尿陽性對照陰性對照第三十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

注意事項待測尿液宜采用晨尿，不能及時檢測檢測的標本應保存于2~8℃，不能使用嚴重蛋白尿、血尿、菌尿標本；試劑應4℃保存，切勿凍存。使用前使試劑接近室溫并搖勻；應同時設置陽性、陰性對照，以排除非特異性凝集；所加液滴應大小一致；結果應在強光下觀察，觀察時應置黑色背景下或稍傾斜反應板。第三十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗結果分析和討論妊娠免疫診斷試驗是臨床常用的經典膠乳凝集抑制試驗，操作簡便、快速、特異性強，停經35～40天以上的孕婦可測得陽性結果。需注意的是，絨毛膜上皮癌、葡萄胎及睪丸畸胎瘤病人尿中HCG含量遠較正常妊娠尿液為高，將尿液作1∶200稀釋后仍可呈陽性反應。待測尿液以晨尿為好。測試時應注意標本及各診斷試劑加入的順序，并設立陽性和陰性對照。試分析若隨意變更加樣順序，如先加標本、再加膠乳抗原，最后加抗HCG或先加膠乳抗原、再加抗HCG，最后加標本，結果如何？

凝集抑制試驗可用于確證呈陽性反應的間接凝集實驗是否是非特異凝集反應，試討論如何進行該項實驗？

第三十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

不完全抗體檢測的實驗設計（設計性實驗）

第三十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗目的

采用紅細胞作為凝集試驗的抗原，創造條件設法使相鄰的紅細胞靠近、聚攏、凝集從而達到對紅細胞不完全抗體的檢測目的。第三十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一問題背景資料

抗體與相應抗原結合后，在適宜的介質參與下可出現可見的抗原抗體反應。但有些分子較小的7S的IgG類抗體，體積小，長度短，在適宜介質中與相應抗原結合后不出現可見反應，這種抗體稱為不完全抗體，如抗紅細胞Rh抗原的抗體等，這種抗紅細胞不完全抗體的存在是引起輸血不良反應的主要原因之一，有必要設計檢測不完全抗體，特別是針對紅細胞抗原不完全抗體的的檢測方法。第三十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗設計的策略不完全抗體只含有一個抗原結合位點，

能與相應抗原結合，但不產生可見反應，因此也稱單價抗體。抗紅細胞不完全抗體與紅細胞結合后，因抗體分子小，不能有效地連接紅細胞，僅使紅細胞處于致敏狀態，而不出現可見的凝集反應。在實驗設計時，基本的思路是采用紅細胞作為凝集試驗的抗原，創造條件設法使相鄰的紅細胞靠近、聚攏、凝集從而達到對紅細胞不完全抗體的檢測目的。第三十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一實驗方案討論凝集反應可分為哪兩個階段？其中可見反應階段主要受哪些因素影響？可否根據影響因素，通過設置低離子強度介質以降低紅細胞的Zeta電位和加入高價陽離子鹽類以中和紅細胞表面負電荷等來促使紅細胞凝集？此時又如何判斷是特異性凝集還是非特異性凝集？紅細胞表面的不完全抗體是IgG，即免疫球蛋白，此時若在反應體系中加入抗人球蛋白，會出現何結果？抗人球蛋白如何制備？如何檢測血清中未與紅細胞結合和與紅細胞結合的不完全抗體？第三十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一免疫凝集分析系統——全自動血型分析系統（臨床見習）

第三十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一基本原理全自動血型分析系統采用柱凝集血型診斷系統試劑卡技術和數字圖像處理技術自動實現人血樣本的體外免疫血液檢測。ABO/Rh血型診斷試劑卡是基于獨特的柱凝集技術原理而設計的。該卡是在一種特制的塑料卡上設計有6個微柱，每個微柱中均裝有一定數量具有分子篩作用的玻璃珠，并分別預置了抗A、抗B、抗D特異性抗體的試劑。當受檢者紅細胞進入測試柱與相應抗體反應并經低速和高速雙相離心后，發生凝集的紅細胞被阻滯在玻璃珠的上層（陽性），而未凝集的游離紅細胞則會在離心力的作用下通過玻璃珠介質之間的間隙沉積于柱的底部（陰性）。由此可將凝集紅細胞與未凝集紅細胞分開，達到鑒定ABO/Rh血型的目的。第四十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一見習內容與要點全自動血型分析系統了解該分析系統的整體結構和工作性能掌握人血樣本體外免疫血液自動檢測的基本原理熟悉整個操作流程第四十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一本實驗以AutoVue＠全自動血型分析系統用于人紅細胞ABO/Rh血型的正定型為例進行介紹整體結構計算機打印機不間斷電源(可選)儲液桶試劑卡AutoVueInnova第四十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一樣本的識別與加樣紅細胞混懸與制備試劑的識別與分配孵育離心結果的閱讀與解釋試劑卡的保存與移動

AutoVueInnova的功能第四十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一AutoVueInnova的檢測菜單ABO/Rh定型ABO反定型Rh表型鑒定病人/獻血員主側與次側交叉配血抗體篩選抗體鑒定直接抗人球蛋白實驗酶實驗特殊血型抗原鑒定質控實驗第四十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一柱凝集血型診斷系統試劑卡每張卡上有六個微柱微柱內裝有一定數量、大小均一的玻璃珠和分別預置了含抗A、抗B、抗D特異性抗體受檢者紅細胞進入測試柱與相應抗體反應經低速和高速雙相離心，發生凝集的紅細胞被阻滯在玻璃珠的上層（陽性），而未凝集的游離紅細胞則會通過玻璃珠介質之間的間隙沉積于柱的底部（陰性）,達到血型鑒定的目的。用于人紅細胞ABO/Rh血型正定型的原理第四十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一微柱凝膠試驗示意圖第四十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一

標本采集和要求血液的采集

用真空采血針取肘靜脈血3ml放入含有干燥抗凝劑的抗凝管中，并做好標識。

采集后的標本可室溫保存4小時，并在6小時內測定。見習內容第四十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一五號柱：抗-B試劑四號柱：抗-A試劑

ABO-Rh血型診斷試劑卡

故每一試劑卡可用于2份人血標本ABO/Rh鑒定一號柱：抗-A試劑二號柱：抗-B試劑三號柱：抗-D試劑(抗-RH1)六號柱：抗-D試劑(抗-RH1)第四十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一全自動血型分析系統基本技術流程圖技術流程第四十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一樣本裝載量:42個試管位，36個位于可移動的扇形架中，6個固定位置獨立的樣本裝載門,主要處理區域的操作不會受到干擾而中斷樣本加樣患者樣本放置在儀器正面的一扇門后面，位于AutoVue的左邊，由移液探針執行樣本吸取并將樣本輸送到檢測區這一步驟，請參見黃色線描出的部分。樣品裝載意示第五十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期一AutoVue可以自動進行結果的讀取與分析,自動讀取器在系統內部離心機所在位置附近讀取試劑卡兩面的信息

高清晰度圖像處理系統標準化和客觀的反應分級如果需要則可進行結果的人工判讀讀取QC來定標試劑卡結果讀取