基因組文庫和cDNA文庫的構建

當前第1頁\共有46頁\編于星期三\11點第一節基因組文庫的構建1基因組文庫(genomielibrary):將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。

作用：獲得特定基因。當前第2頁\共有46頁\編于星期三\11點2基因組文庫的類型根據所選用的載體可以分為：質粒文庫噬菌體文庫黏粒文庫人工染色體文庫當前第3頁\共有46頁\編于星期三\11點3構建基因組文庫應滿足的條件3.1文庫的完整性要包含基因組的完整序列信息，通過產生一系列一定大小、覆蓋全基因組的DNA片段的重組克隆來實現。

當前第4頁\共有46頁\編于星期三\11點限制性內切酶……克隆、轉化、培養、鑒定基因組DNA基因組文庫當前第5頁\共有46頁\編于星期三\11點3.2基因組信息的可重建性通過建立疊連群(contig)重建完整序列信息。當前第6頁\共有46頁\編于星期三\11點3.3文庫的大小即文庫中應包含的獨立重組子數。一般來說，DNA片段長，完整基因組文庫所含的克隆數越少。反之，越多。基因組越大，文庫應包含的克隆數越多，反之，越少。當前第7頁\共有46頁\編于星期三\11點4基因組文庫的質量標準一個理想的基因組DNA文庫應具備下列條件：重組克隆的總數不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆；克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區域，以利克隆排序；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；重組克隆能穩定保存、擴增、篩選。當前第8頁\共有46頁\編于星期三\11點5基因組DNA文庫構建的程序

(噬菌體基因組文庫的構建)

⑴基因組DNA的分離制備不同來源的DNA制備方法不同。一般來說，有液相法和固相法兩種。液相法提取的DNA長度一般在100kb左右，基本可以滿足構建各種小插入片段基因組文庫的要求。當前第9頁\共有46頁\編于星期三\11點大相對分子質量(highmolecularweight,HMW)基因組DNA的提取方法當前第10頁\共有46頁\編于星期三\11點當前第11頁\共有46頁\編于星期三\11點⑵基因組DNA的片段化①酶切部分酶切的主要目的是產生隨機性的DNA片段用于構建基因組文庫。②DNA分子的物理剪切DNA溶液的小孔噴射超聲波處理高速攪拌

當前第12頁\共有46頁\編于星期三\11點⑶載體的制備要求：載體的去磷酸化處理載體的純度

當前第13頁\共有46頁\編于星期三\11點⑷重組連接按照連接酶催化反應的最適條件設置反應體系，同時還應通過預備性實驗確立反應體系具體的參數。當前第14頁\共有46頁\編于星期三\11點⑸噬菌體離體包裝⑹重組噬菌體感染大腸桿菌

當前第15頁\共有46頁\編于星期三\11點6基因組文庫的擴增篩選⑴文庫的擴增基于噬菌體載體的基因組文庫通過感染大腸桿菌，重組噬菌體在受體細胞中復制增殖并形成噬菌斑以實現增殖。

風險：在進行文庫擴增時，很難保證重組分子均等增殖。所以造成有些克隆丟失，有的增加，有的減少。

當前第16頁\共有46頁\編于星期三\11點⑵文庫的篩選噬菌斑原位雜交PCR文庫篩選當前第17頁\共有46頁\編于星期三\11點基因組DNA文庫限制性內切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝當前第18頁\共有46頁\編于星期三\11點第二節cDNA文庫構建高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時間階段的單個細胞或個體中，有15%左右的基因得以表達，產生約15000種不同的mRNA分子。可見，由mRNA出發的cDNA克隆，其復雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。當前第19頁\共有46頁\編于星期三\11點1概念cDNA文庫：

將生物特定的組織器官或特定時期的全部mRNA反轉錄成cDNA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達基因的轉錄本。當前第20頁\共有46頁\編于星期三\11點2cDNA文庫優點

⑴cDNA克隆以mRNA為材料，特別適合某些病毒基因組結構研究及有關基因的克隆分離。⑵cDNA文庫的篩選比較簡單易行。⑶每一個cDNA克隆對應一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現假陽性的概率就會比較低，因此陽性的雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因序列。⑷可以在原核中表達。當前第21頁\共有46頁\編于星期三\11點3對cDNA文庫質量評價3.1文庫的代表性文庫中包含的重組cDNA分子反映來源細胞中表達信息的完整性。3.2重組cDNA片段的序列完整性。當前第22頁\共有46頁\編于星期三\11點4cDNA文庫構建的步驟⑴分離mRNA；⑵富集mRNA；⑶cDNA的合成；⑷黏性末端片段與載體的連接；⑸離體包裝獲得重組噬菌體；⑹檢測重組噬菌體效價。當前第23頁\共有46頁\編于星期三\11點cDNA文庫的構建：基因重組反轉錄酶mRNAcDNA當前第24頁\共有46頁\編于星期三\11點當前第25頁\共有46頁\編于星期三\11點4.1細胞總RNA的提取和mRNA的分離RNA：tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%）

真核生物的mRNA具有一個polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離；

oligo(dT):polyA雜交鏈在高鹽離子濃度下可以保持，在低鹽離子濃度下或較高溫度下就會分開，利用這一性質從RNA中分離純化mRNA。

當前第26頁\共有46頁\編于星期三\11點當前第27頁\共有46頁\編于星期三\11點當前第28頁\共有46頁\編于星期三\11點4.2cDNA第一鏈的合成①

oligo(dT)引導的DNA合成法

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉錄酶合成cDNA的第一鏈。

當前第29頁\共有46頁\編于星期三\11點當前第30頁\共有46頁\編于星期三\11點②隨機引物引導的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)根據許多可能的序列，合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發生，而不僅僅從3’-末端的oligo(dT)引物一處開始。當前第31頁\共有46頁\編于星期三\11點4.3第二鏈cDNA的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA:cDNA雜合雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈的合成的方法大致4種：自身引導合成法置換合成法引導合成法引物－銜接頭合成法

當前第32頁\共有46頁\編于星期三\11點①自身引導合成法

獲得的單鏈cDNA3’端會形成發夾結構的能力，以此作為第二鏈合成的引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。

當前第33頁\共有46頁\編于星期三\11點當前第34頁\共有46頁\編于星期三\11點②置換合成法

以第一鏈合成產物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈。當前第35頁\共有46頁\編于星期三\11點RNaseH：特異水解與DNA雜交的RNA上的磷酸二酯鍵，產生帶有3‘—OH和5’—P的產物當前第36頁\共有46頁\編于星期三\11點③引導合成法

當前第37頁\共有46頁\編于星期三\11點④引物-銜接頭法當前第38頁\共有46頁\編于星期三\11點5全長cDNA文庫(fulllengthcDNAlibrary)導致cDNA不完整的原因：

①cDNA第二鏈合成中聚合酶的外切核酸酶活性

②mRNA的降解，它容易從5‘端降解。起始生物材料、抽提和純化過程中RNase的污染、機械斷裂.

③反轉錄酶的合成特性

與mRNA的分子結構有關

與反轉錄酶從轉錄復合體上脫離有關

當前第39頁\共有46頁\編于星期三\11點oligo(dG)引導合成全長dscDNA

當前第40頁\共有46頁\編于星期三\11點載體引導合成全長dscDNA

當前第41頁\共有46頁\編于星期三\11點置換法合成全長dscDNA

當前第42頁\共有46頁\編于星期三\11點6基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較cDNA文庫只包含某種生物體特定組織、特定發育階段表達的基因(具有時空特異性)。基因組文庫的出發材料是完整的生物基因組DNA，每一個基因都存在于完全的基因組文庫中，并不受生物組織或發育時期的影響。當前第43頁\共有46頁\編于星期三\11點

cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結構，沒有包括基因組的間隔序列，cDNA文庫中，不同克隆的分布狀態總是反映著mRNA的分布狀態，即：高豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較低，分離基因困難；