高速逆流色譜色譜技術類型01技術簡介發展史構造原理應用領域主要特點目錄030502040607分配系數影響因素研究發展溶劑體系技術發展目錄0901108010基本信息高速逆流色譜儀(High-speedCountercurrentChromatography，簡稱HSCCC)，于1982年由美國國立衛生院Ito博士研制開發的一種新型的、連續高效的液液分配色譜技術。技術簡介技術簡介高速逆流色譜高速逆流色譜(highspeedcountercurrentchromatography，簡稱HSCCC)是一種液-液色譜分離技術，它的固定相和流動相都是液體，沒有不可逆吸附，具有樣品無損失、無污染、高效、快速和大制備量分離等優點。由于HSCCC與傳統的分離純化方法相比具有明顯的優點，因此此項技術己被廣泛應用于中藥成分分離、保健食品、生物化學、生物工程、天然產物化學、有機合成、環境分析等領域。我國是繼美國、日本之后最早開展逆流色譜應用的國家。張天佑等在國內首先自行研制了分析型和制備型的高速逆流色譜儀，對我國中藥功能成分的分離制備取得了顯著成果。上海同田生化技術有限公司生產的高速逆流色譜儀，分離中藥成分純度達到99%，可用于HPLC檢測標準樣。高速逆流色譜（high-speedcountercurrentchromatography，HSCCC）是20世紀80年代發展起來的一種連續高效的液—液分配色譜分離技術，它不用任何固態的支撐物或載體。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡，當其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續洗脫的過程中能保留大量固定相。由于不需要固體支撐體，物質的分離依據其在兩相中分配系數的不同而實現，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適合于天然生物活性成分的分離。而且由于被分離物質與液態固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。原理原理1.逆流色譜是20世紀50年代源于多極萃取技術（非連續性）多極萃取技術但是多極萃取設備龐大復雜、易碎、溶劑體系容易乳化，溶劑耗量大，分離時間長。2.通過公轉、自轉（同步行星式運動）產生的二維力場，保留兩相中的其中一相作為固定相高速逆流色譜原理2.通過高速旋轉提高兩相溶劑的萃取頻率，1000rpm旋轉時可達到17次/s頻率的萃取過程。高速逆流色譜原理23.HSCCC分離流程圖HSCCC分離流程圖發展史發展史1．20世紀70年代，出現了液滴逆流色譜（DCCC）特點：（1）流體靜力學原理（Hydrostaticequilibriumsystem，HSES）（2）分離時間過長、連接處容易出現滲漏等2．20世紀70年代出現了離心分配色譜儀（Centrifugalpartitionchromatography，CPC）離心分配色譜特點：（1）基于流體靜力學原理（Hydrostaticequilibriumsystem，HSES），利用公轉產生的單一力場（2）連接處較多而且容易出現滲漏，清洗維護復雜3．20世紀80年代開始出現了高速逆流色譜，可稱為最先進的逆流色譜特點：（1）基于流體動力學原理（Hydrodynamicequilibriumsystem，HDES）應用領域應用領域（1）天然產物已知有效成分的分離純化（2）化學合成物質的分離純化（3）中藥一類、五類新藥的開發（4）中藥指紋圖譜和質量控制研究（5）抗生素的分離純化（6）天然產物未知有效成分的分離純化（新化合物開發）（7）海洋生物活性成分的分離純化（8）放射性同位素分離（9）多肽和蛋白質等生物大分子分離以及手性分離等構造構造儀器的中心部分：(a)ITO多層線圈分離柱，它是由100-200毫米長、內徑為1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有適當內徑的內軸共繞十多層而成，其管內總體積可達300mL左右。(b)平衡器，它可以調節重量，它的作用是讓(a)，(b)相對于中心軸兩邊重量平衡。當在旋轉控制器的控制下，在齒輪傳動裝置作用下，(a)，(b)同時繞中心軸作順時針或反時針的行星運動，即(a)-(b)本身既在自轉，但同時又在繞中心軸公轉，公轉轉速可從0-4000r/min。從線圈分離柱中通過中空的中心軸還同時牽引出了線圈的兩端，一端供泵入液用，一端輸出液體。儀器工作需要互不相溶的兩種液體，一相作固定相，一相作移動相。儀器工作前，先將作為固定相一相的液體通過恒流泵壓入線圈分離柱，然后用進樣器將待分離的樣品進樣，最后用恒流泵壓入移動相，同時啟動中心部分運轉直到轉速大于600r/min。此時，兩相在線圈分離柱中具有相對運動之勢。由于移動相源源不斷的壓入，阻止了固定相的流出，同時，移動相帶著樣品在線圈分離柱中進行無限次的分配而使復雜樣品得到分離。當移動相經過檢測器時，由于不同的樣品組分會產生不同大小的信號，用記錄儀就能得到逆流色譜圖譜，同時用餾分收集器分步收集移動相就會得到復雜樣品被分開的組分。較大的制備型HSCCC，柱容積可達530m1，一次最多進樣可達20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8m1，進樣量為幾十微克，最大轉速可達4000r/min，分析能力堪與HPLC相媲美。主要特點主要特點應用范圍廣，適應性好由于溶劑系統的組成及配比可以是無限多的，因而從理論上講可以適用于任何極性范圍內樣品的分離，在分離天然化合物方面具有其獨到之處。由于聚四氟乙烯管中的固定相為液體不需要固相載體，因而可以消除固-液色譜中由于使用固相載體而帶來的吸附損失，特別適用于分離極性物質。操作簡便，容易掌握儀器操作簡單，對樣品的預處理要求低，一般的粗提物即可進行的制備分離或分析。回收率高不需要固相載體，消除了由于樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，理論上樣品的回收率可達。在實驗中只要調整好分離條件，一般都有很高的回收率。重現性好如果樣品不具有較強的表面活性作用，酸堿性也不強，即使多次進樣，其分離過程都保持很穩定，而且重現性相當好。分配系數分配系數溶劑系統的選擇是同時選擇色譜分離過程的兩相，是對樣品成功分離的關鍵所在，而樣品中各組分的分配系數決定著這種溶劑系統是否合適，因此分配系數的測定是選擇溶劑系統的重要環節。分配系數的測定多采用薄層色譜法、毛細管電泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。溶劑體系溶劑體系高速逆流色譜常用基本溶劑體系表上表中是根據被分離物質的極性列出一些基本的可供參考的溶劑體系，它包括非水體系和含水體系。溶劑系統的選擇對于HSCCC分離十分關鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統的選擇還沒有充分的理論依據，而是根據實際積累的豐富經驗來選擇。通常來說，溶劑系統應該滿足以下要求：溶劑系統不會造成樣品的分解或變性樣品中各組分在溶劑系統中有合適的分配系數，一般認為分配系數在0.2-5的范圍內是較為合適的，并且各組分的分配系數值要有足夠的差異，分離因子最好大于或等于1.5；溶劑系統不會干擾樣品的檢測；為了保證固定相的保留率不低于50%，溶劑系統的分層時間不超過30秒；上下兩相的體積比合適，以免浪費溶劑；盡量采用揮發性溶劑，以方便后續處理盡量避免使用毒性大的溶劑。根據溶劑系統的極性，可以分為弱極性、中等極性和強極性三類。經典的溶劑系統有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在實驗中，應根據實際情況，總結分析并參照相關的專著及文獻，從所需分離的物質的類別出發去尋找相似的分離實例，選擇極性適合的溶劑系統，調節各種溶劑的相對比例，測定目標組分的分配系數，最終選擇合適的溶劑系統。影響因素影響因素1.固定相的保留值在逆流色譜中，留在管中固定相的量是影響溶質峰分離度的一個重要因素，高保留量將會大大改進峰分離度。儀器對保留值的影響（外因）研究表明：螺旋管支持件的自轉半徑r與公轉半徑R之比B值是一個影響兩相互不混溶溶劑在旋轉螺旋管內保留的關鍵因素。用大直徑的支持件使值進一步提高，能導致親水性溶劑體系的單向性流體動力學分布反向；反之，用小直徑的支持件使值減小，能使疏水性溶劑體系的單向性流體運動方向反向，而介于疏水性和親水性溶劑之間的中間極性溶劑，其兩相分布狀況則會受到離心力條件的影響。溶劑體系物理因素對保留值的影響（內因）溶劑體系的物理因素如溶劑的黏度對固定相的保留影響很大，低黏度的溶劑體系可望得到高的固定相保留，界面張力和兩相間的密度差會對溶劑在臨界點附近的分層時間產生較大的影響，一般為保證固定相保留值合適，溶劑體系的分層時小于30s。2.轉速的影響螺旋管的旋轉速度對兩相溶劑在流體動力學平衡時的體積比，也就是對固定相的保留值的影響很大，從而影響了分離效果。技術發展技術發展二十世紀六十年代，首先在日本，隨后在美國國家醫學研究院發現了一種有趣的現象：即互不相溶的兩相溶劑在繞成螺旋形的小孔徑管子里分段割據，并能實現兩溶劑相之間的逆向對流。Ito及其后來者在此基礎上研究并設計制造出了一系列逆流色譜裝置，早期的是封閉型的螺旋管行星式離心分離儀CPC（coilplanetcentrifuge），用于分離染料，蛋白質和細胞粒子。數年后Ito把流通機制引入到螺旋管柱體系中，使逆流色譜和現代色譜一樣可以實現連續的的洗脫、分離、檢測和收集，并建立了兩個基本的流通體制。其中有在比較簡單的流體靜力學平衡體制HDES基礎上開發的作為分析分離的CCC、用作制備分離的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流體動力學平衡體制HDES為基礎，研制出在重力場作用下的大制備量分離儀器和在離心力場作用下的分析型和半制備型分離儀器。研究發展研究發展溶劑體系的選擇范圍越來越寬泛，有人提出用超臨界二氧化碳做流動相，利用它的高擴散性、低粘度、流體特性及環境友好等其他溶劑不可比擬的優勢分離化合物，還有人提出用制冷劑做流動相的可能性。還有人提出將三相溶劑體系用于高速逆流色譜分離中，可以對寬極性范圍的樣品進行很好的分離。三相溶劑還只用于標準品混合物的分離，還沒能用于具體天然產物的分離，相信進行進一步的發展在復雜天然產物以及藥物的分離中有很大應用前景。pH區帶逆流色譜是一種最新發展起來的制備色譜技術，它能使樣品的負載容量提高10倍以上，即使含量很低的物質也能得到高度濃縮。它是在固定相和流動相中加入一對試劑——保留劑和洗脫劑，保留劑用來把樣品中的各組分保留在管柱內，當含有洗脫劑的流動相以一定流速穿過固定相時，由于酸堿反應最