牙髓培養(yǎng)細(xì)胞體外誘導(dǎo)礦化能力：冠髓與根髓的比較【摘要】目的比較人牙髓的根、冠髓培養(yǎng)細(xì)胞體外誘導(dǎo)礦化能力，探討牙髓干細(xì)胞在牙髓中的定位。方法用組織塊法對(duì)人牙的根髓和冠髓細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，將第五代培養(yǎng)細(xì)胞用條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)礦化，在誘導(dǎo)后第10、20、30天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行VonKossa鈣染色。結(jié)果根髓中形成的礦化小結(jié)比冠髓中更早、更強(qiáng)烈。結(jié)論根髓比冠髓更容易誘導(dǎo)礦化。牙髓干細(xì)胞可能存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【關(guān)鍵詞】牙髓干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；礦化結(jié)節(jié)

Theinducedmineralizationabilityincultureddentalpulpcells:thecomparationbetweencoronalandrootpulpcells

【Abstract】ObjectiveTocomparethemineralizationabilitybetweencultureddentalrootandcoronalpulpcells,andtoinvestigatethelocalizationofdentalpulpstemcells(DPSCs)indentalpulps.MethodsThehumandentalrootandcoronalpulpcellswereculturedintissue-explantmethod,the5thgenerationofcellsweresubculturedwithconditioningmedium(20%DMEM+10nmol/L+dexamethasone+50mg/Lascorbicacid)toinducemineralization.Atthedaysof10,20,30afterinducing,vonKossaforcalciumstainingwasusedtoinvestigatethemineralizationabilityinrootandcoronalpulpcells.ResultsThemineralizationnodulesappearedearlierandstrongerintherootpulpcellsthanthatinthecoronalpulpcellsobservedinphase-contrastmicroscopeandvonKossastaining.ConclusionRootdentalpulpcellscouldbeinducedtomineralizationmoreeasilythanthecoronalpulpcells.DPSCsmayexistinbothrootandcoronalpulp,anditsdensityintherootpulpishigherthanthatincoronalpulp.

【Keywords】dentalpulpstemcells；cellculture；mineralizationnodules

牙髓干細(xì)胞在成體牙髓腔中的定位問題是牙體組織工程學(xué)中尚未解決的基本問題。研究表明，體外培養(yǎng)的DPSCs和骨髓干細(xì)胞一樣，都具有在一定條件下誘導(dǎo)礦化形成礦化小結(jié)的能力，礦化小結(jié)的形成是DPSCs分化的標(biāo)記。本文通過對(duì)體外培養(yǎng)的人牙髓髓細(xì)胞誘導(dǎo)礦化，并對(duì)其礦化能力進(jìn)行比較，以探討DPSCs在牙髓中的定位。

1材料與方法

主要實(shí)驗(yàn)器材及試劑CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；相差顯微鏡；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板；高速離心機(jī)；細(xì)胞記數(shù)板；高糖DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；地塞米松；L-抗壞血酸；β-甘油磷酸鈉。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)收集5顆16～25歲健康人因正畸或阻生而拔出的第三磨牙，在無菌條件下分別取其根髓和冠髓，用組織塊法進(jìn)行細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)［1］，培養(yǎng)液為DMEM。

細(xì)胞染色分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的冠髓和根髓細(xì)胞接種于有蓋玻片的6孔板上，當(dāng)細(xì)胞匯合約60%～70%時(shí)，改用條件培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)30天。在倒置相差顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。分別于10、20、30天時(shí)，取出蓋玻片，按VonKossa法進(jìn)行染色。染色方法取出長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋片，PBS沖洗3遍，F(xiàn)AA固定液中固定30min。蒸餾水沖洗3次。固定后的細(xì)胞加入5%的硝酸銀溶液，良好日光下染色1h，蒸餾水沖洗，5%的硫代硫酸鈉作用1～2min，再用蒸餾水洗5min，干后封片，或伊紅復(fù)染，常規(guī)脫水后封片。

結(jié)果判斷：礦化結(jié)節(jié)被染成深黑色。

對(duì)照設(shè)計(jì)體外培養(yǎng)的牙周韌帶細(xì)胞具有較強(qiáng)的鈣化能力，用作VonKossa鈣染色的陽性對(duì)照片。

2結(jié)果

相差顯微鏡下觀察在礦化培養(yǎng)2天時(shí)，根髓細(xì)胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，細(xì)胞間隔消失，冠髓細(xì)胞無明顯變化；礦化培養(yǎng)10天時(shí)，根髓細(xì)胞呈局灶性復(fù)層生長(zhǎng)，呈網(wǎng)狀或束狀排列；15天時(shí)，根髓復(fù)層中央部分細(xì)胞進(jìn)一步密集，形成細(xì)胞結(jié)節(jié)，冠髓細(xì)胞開始出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)；礦化培養(yǎng)20天時(shí)，根髓細(xì)胞結(jié)節(jié)中央出現(xiàn)黑色高密度物質(zhì)沉積，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)增多，冠髓細(xì)胞結(jié)節(jié)中央開始出現(xiàn)少量褐色沉積物；礦化30天時(shí)，根髓出現(xiàn)明顯的黑色礦化結(jié)節(jié)，冠髓中有小而少的礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)。

VonKossa法鈣鹽染色

根髓細(xì)胞于誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時(shí)，在細(xì)胞結(jié)節(jié)中央出現(xiàn)被染成黑褐色的小塊，表明鈣質(zhì)沉積。誘導(dǎo)培養(yǎng)30天時(shí)，黑色小塊進(jìn)一步增大(見圖1略)。

冠髓細(xì)胞20天時(shí)，尚無染色陽性礦化結(jié)節(jié)形成。30天時(shí)，少數(shù)區(qū)域出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，體積較小且強(qiáng)度微弱(見圖2略)。

陽性對(duì)照片相同染色條件下體外培養(yǎng)的牙周韌帶細(xì)胞出現(xiàn)黑色團(tuán)塊。

3討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外持續(xù)培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞在誘導(dǎo)劑作用下經(jīng)歷了融合期、復(fù)層生長(zhǎng)期、細(xì)胞結(jié)節(jié)形成期而最后發(fā)生礦化，這與Tsukamoto等［2］的觀察相一致。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞能復(fù)層生長(zhǎng)，在一定條件下能分泌形成類牙本質(zhì)樣的礦化結(jié)節(jié)［3］。結(jié)節(jié)中細(xì)胞是處在分化中的成牙本質(zhì)細(xì)胞前期,體外培養(yǎng)單層生長(zhǎng)的細(xì)胞不具有形成礦化基質(zhì)的能力而牙髓細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)可以形成細(xì)胞結(jié)節(jié)，細(xì)胞結(jié)節(jié)所具有的三維結(jié)構(gòu)是形成鈣化的先決條件［4］。

牙髓干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)可以形成礦化結(jié)節(jié)，礦化結(jié)節(jié)的形成代表了牙髓干細(xì)胞的存在。由于礦化的形成是牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)在相同誘導(dǎo)條件下根髓比冠髓礦化發(fā)生得早，說明根髓中牙髓干細(xì)胞的密度高于冠髓，或者根髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的潛能比冠髓細(xì)胞大。

對(duì)DPSC存在的部位存在著不同的認(rèn)識(shí)。牙齒的發(fā)生是由上皮與間充質(zhì)相互作用下完成的，根尖區(qū)是牙根的生發(fā)中心。從牙齒發(fā)育學(xué)角度考慮，牙髓干細(xì)胞主要存在于根尖區(qū)。Harada采用器官培養(yǎng)方法對(duì)切牙根尖末端培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由新分化形成的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了釉質(zhì)和牙本質(zhì),表明干細(xì)胞起源于根尖區(qū)的頸環(huán)上皮［5］。

牙髓是牙齒發(fā)育完成之后存留于牙髓腔中的疏松結(jié)締組織，牙髓中的成牙本質(zhì)細(xì)胞可不斷分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，并礦化形成牙本質(zhì)。若受到刺激，將導(dǎo)致受刺激部位的成牙本質(zhì)細(xì)胞變性壞死，將由新分化形成的成牙本質(zhì)細(xì)胞取代，并形成修復(fù)性牙本質(zhì)。刺激常發(fā)生于冠部，所以修復(fù)性牙本質(zhì)常出現(xiàn)在冠部。該現(xiàn)象說明牙冠部就存在著能分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的牙髓干細(xì)胞,還可能是牙齒受到刺激后，通過Nortch信號(hào)傳遞，牙髓干細(xì)胞由根部的干細(xì)胞遷移分化而來［6］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的相差顯微鏡觀察和茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)根、冠髓細(xì)胞在一定誘導(dǎo)條件下皆具有形成礦化結(jié)節(jié)的能力，說明根髓和冠髓中都存在牙髓干細(xì)胞。

對(duì)于冠部、根部牙髓組織學(xué)特征，Murray等［7］做了研究比較，發(fā)現(xiàn)冠部細(xì)胞密度要高于根部，但根部牙本質(zhì)沉積率卻比冠部高。這種現(xiàn)象說明根部牙本質(zhì)的高沉積率不是成牙本質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量導(dǎo)致的,而與根部成牙本質(zhì)細(xì)胞的功能活躍有關(guān)。提示冠部、根部牙本質(zhì)分泌的機(jī)制存在差異。研究發(fā)現(xiàn)隨年齡的增長(zhǎng)，根髓較快的發(fā)生退行性變?nèi)缂?xì)胞數(shù)量的減少、纖維增多、髓石形成等。因而可以認(rèn)為，冠、根部的種種差異與干細(xì)胞在冠髓根髓中的密度密切相關(guān)。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)［1,8,9］，根髓細(xì)胞比冠髓細(xì)胞更容易培養(yǎng)，根髓細(xì)胞的堿性磷酸酶活性高于冠髓，牙髓細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)礦化并經(jīng)茜素紅染色后，根髓比冠髓中具有更強(qiáng)的紅色結(jié)節(jié)。這從牙髓干細(xì)胞的功能角度說明DPSCs存在于全部牙髓中，而且主要位于根髓之中。

4結(jié)論

體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞中礦化小結(jié)的形成代表了DPSCs的存在，根部牙髓比冠部牙髓細(xì)胞更易于誘導(dǎo)礦化，提示DPSCs存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【參考文獻(xiàn)】

1劉少華，魏奉才，孫善珍,等.牙髓細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法探討：冠部和根部牙髓的比較.上海口腔醫(yī)學(xué)，2004，13:103-105.

2TsukamotoY,FukutaniS,Shin-IkeT,etal.Mineralizednoduleformationbyculturesofhumandentalpulp-derivedfibroblasts.ArchOralBiol,1992,37(12):1045-1055.

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4SudoH,KodamaHA,AmagaiY,etal.Invitrodifferentiationandcalcificationinanewclonalosteogeniccelllinederivedfromnewbornmousecalvaria.JCellBiol,1983,96(1):191-198.

5HaradaH,KettunenP,JungHS,etal.LocalizationofputativestemcellsindentalepitheliumandtheirassociationwithNotchandFGFCellBiol,1999,147(1):105-120.

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7MurrayPE,StanleyHR,MatthewsJB,etal.