單雙波長的使用第1頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一概念

波長：是在空間或者沿著導線傳輸的一個波形信號中，相鄰周期且同樣端點之間的距離。

單波長：就是使用一種對顯色具有最大吸收的波長即450或492進行比色測定。雙波長：除了用對顯色具有最大吸收的波長外，同時對特異性顯色不敏感的波長如630nm進行測定。

第2頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一第3頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題一問：酶標儀常用波長有那些？答：不同型號的酶標儀安裝的濾光片不一樣。如：BIO-RAD-550標準波長：405、450、490、655也可選用400~700nmMK3標準波長：405、450、492、630也可選用340~750nm結合工作中實際情況合理的選擇酶標儀型號第4頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題二問：為什么試驗中的常用波長是450或492nm，少部分是405,而不是其他的波長？答：1.了解市場

2.特定波長：在特定條件下測定每一種物質都有其特定的波長，在此波長下，此物質能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長

第5頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題二3.學習兩個原理

3.1.TMBDAB+聯苯醌（在450nm處有最大的消光系數）So:ELISA中，底物反應顯色后，常選擇其具最大吸收的波長450比色測定結果。3.2.pNPPpNP（在405nm處有最大的消光系數）HRP\H2O2AP第6頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題三

問：為什么有的波長需要添加一個副波長？而且常用的是630nm？答：1.Madersbacher和Berger做了個實驗首先是用450和405測定一系列的已知濃度的標準本品，證實450/405Z之比為3.2;其次用405測定很低濃度的標準品的OD值再乘以常熟3.2，即為待測樣本在波長450的值。第7頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題三

證明：雙波長測定可以提高ELISA的敏感度。2.每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。3.630nm下得到的吸光度是非特異性，主要來時于板塊上諸如指紋、灰塵，贓物等所致的吸收。

第8頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題四問：雙波長測定時OD結果是如何計算得出的？答：樣本值=敏感值-非敏感值敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。第9頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一實驗分析1第10頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題五問:單波長測定的干擾因素有那些？答：1.內源性干擾包括噪音、漂移、電壓等

2.表面張力的影響

3.重復性差第11頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一問題六問:雙波長測定的優點？1.一般不必設空白孔。仍設空白孔，就可能會出現負值。2.能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點。3.重復性好。第12頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一實驗分析2刮花前刮花前刮花后刮花后第13頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一總結現象：1.單雙的結果差異比較大2.刮花對雙波長的影響比較的小討論：結論：運用雙波長不會影響靈敏度，反而會減少其他因素的干擾。建議酶免法測定使用雙波長，這樣可以提高臨界值附近樣本結果判斷的準確度，減少實驗誤差。第14頁，共17頁，2023年，2月20日，星期一波長選擇原理

1.首先要確定顯色液的最大吸收峰

聯苯聯苯醌：450nm甲苯、二甲苯：465nm硝基酚：405nm2.結合試劑說明書選擇波長

用酶標儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值（用單波長測定時需用空白對照孔調零），