第三章

核酸NucleicAcid

DNA堿基順序的測定

RNA堿基順序的測定第四節

核酸堿基序列順序分析

(Sequenceanalysisofnucleicacids)DNA堿基順序測定的基本步驟DNA片斷的制備DNA堿基順序測定

雜交測序法質譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法

化學降解法

(Maxam-Gillbert法,1977)雙脫氧鏈終止法

(sanger法,1977)新技術方法核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis經典方法一、以化學裂解反應為基礎—化學降解法基本原理：基于有機化學方法，選擇性地切斷核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯鍵，得到不同鏈長的DNA小片段；將這些片段經電泳分離；分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。主要兩個步驟：堿基選擇性水解；對水解產物DNA小片段進行電泳分析和堿基順序的推斷。硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中嘌呤堿基選擇性水解，分別得到兩種嘌呤堿基的甲基化產物：N3-甲基腺嘌呤核苷和N7-甲基鳥嘌呤核苷；肼：使DNA分子中嘧啶堿選擇性水解，胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環斷裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙3′-位的磷酸酯鍵則被水解斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。特異性堿基化學切割反應(1)化學裂解法測定DNA的核苷酸序列返回二、以使用DNA聚合酶為基礎--DNA鏈末端終止法

基本原理：以DNA的酶促合成為基礎，以被測DNA單鏈為模板，通過特殊設計的“末端終止技術合成出一系列相差一個核苷酸長度的互補鏈，然后利用凝膠電泳分離這些不同長度的DNA小片段，以此推測確定待測DNA鏈的堿基順序。主要步驟包括：末端終止法合成不同長度DNA小片段；DNA小片段電泳圖譜解析。1977年sanger發明末端終止法“加減法”Sanger雙脫氧終止法DNA酶法測序DNA自動測序儀Sanger法發展過程*少一個－OH脫氧核苷酸與雙脫氧核苷酸結構2、雙脫氧鏈終止法基本原理：?直接引入雙脫氧核苷三磷酸作為鏈終止劑；?將待定DNA片斷分為4組，在反應體系中仍然以DNA單鏈為模板，需要引物、

DNA聚合酶和4種dNTP(其中一種用32P/35S標記)、一定比例不同種類的終止劑2，3-雙脫氧三磷酸(ddNTP，特異性末端終止劑)；?在DNA合成反應混合物的4種dNTP加入少量的一種ddNTP后，鏈的延伸將與偶而發生但卻非常特異的鏈終止競爭，反應產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現過早鏈終止的位置之間的距離。分別得到ddAddTddGddC結尾的片段。返回DNA酶法測序三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產物經電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發不同大小DNA片段上的熒光分子使之發射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產物的平均鏈長取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時，得到較短的產物；“標記／終止法”測序產物的平均長度可通過標記反應中dNTP濃度(高濃度能得到長的產物)或終止反應的ddNTP:dNTP來調整。第二步熒光檢測DNA帶負電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關DNA自動測序結果RNA堿基順序測定方法RNA鏈堿基順序的測定比較復雜；逆轉錄法，以待測的RNA鏈為模板，在逆轉錄酶純化下，合成DNA(與RNA互補的DNA分子，常用cDNA表示)；用化學降解法

或雙脫氧鏈終止法測定DNA堿基順序，再得出RNA的堿基順序。應用一套已知序列的寡核苷酸探針去尋找靶DNA鏈上的互補序列，靶DNA上的序列根據雜交情況來確定。雜交測序核酸分子的核苷酸序列分析是以純品核酸為材料，經水解，測定核苷酸組成及比例；先以外切酶確定5′-或3′-末端核苷酸，再以內切酶將核酸鏈分為若干寡核苷酸段，分段測定核苷酸組成、比例和序列；最后將核苷酸序列的各寡核苷酸重疊，確定整個核酸分子的核苷酸序列。核酸堿基順序測定酶底物作用部位作用產物外切酶磷酸二酯酶DNA，

RNA5′端，5′連接處3′核苷酸3′端，3′連接處5′核苷酸內切酶脫氧核糖核酸酶IDNA3′連接處3′-羥核苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分脫氧核糖核酸酶II5′連接處3′-核苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸酶T1RNA5′連接處堿基是G3′-鳥苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸酶I5′連接處堿基是

Pyr3′-嘧啶類核苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分核苷酸序列分析中斷裂磷酸二酯鍵用酶返回第五節

核酸的催化性質

Thecatalyticpropertiesofnucleicacids核酶（Ribozyme）核酶的發現核酶的催化性質核酶的研究中的兩個問題核酶的發現Altman發現RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而RNA部分在有足夠濃度Mg2+離子存在下，能起核酸水解酶的作用。Cech發現RNA原生動物四膜蟲的Pre-rRNA是一種具有自催化性能的核酶。證明了核酸既是信息分子，又是功能分子

核酶催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脫氧核苷酸片段，也能序列特異性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)

序列特異性的核酸內切酶參與RNA轉錄后加工修飾作為針對病毒或腫瘤基因的藥物降解mRNA。

核酶的催化性質RNA作用于RNA核酸酶催化的反應主要包括:水解反應(RNA限制性內切酶活性)，連接反應(聚合酶活性)和轉核苷酰反應等。最近核酸酶的其他作用底物也已被發現，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。核酶的催化過程圖轉酯作用轉酯作用核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依據底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)RNA酶(ribonuclease,RNase)依據切割部位不同分類核酸內切酶：

限制性核酸內切酶非特異性核酸內切酶核酸外切酶：

5′→3′或3′→5′核酸外切酶。參與DNA的合成與修復及RNA合成后的剪接等重要基因復制和基因表達過程負責清除多余的、結構和功能異常的核酸，同時也可以清除侵入細胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收體外重組DNA技術中的重要工具酶生物體內的核酸酶負責催化細胞內外核酸的降解

核酸酶的功能

ThecrystalstructureoftheL1ligaseribozyme.(Credit:M.RobertsonandW.Scott(Science,March16,2007)“誰先出現的呢，核酸還是蛋白質？”這個問題先前被看作是一個極難處理的矛盾，但隨著核酶的發現，現在可以想象一個生命起源以前的‘RNA世界’，那里自我復制的酶執行兩種功能。《科學》雜志期刊X射線衍射技術確定核酶晶體結構

TheStructuralBasisofRibozyme-CatalyzedRNAAssemblyMichaelP.RobertsonandWilliamG.Scott

Science16March2007:1549-1553.

ASYNTHETICRIBOZYMECATALYZESTHEBONDFORMATIONNECESSARYFORRNASYNTHESISBYTRANSITION-STATESTABILIZATIONANDACID-BASECATALYSIS,PERHAPS