第1

節(jié)

分子印跡與雜交技術(shù)

現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

把不同來源而具有一定同源性的DNA分子放在同一溶液中做變性處理，或把單鏈DNA與RNA放在一起，在一定條件下，它們之間的同源區(qū)域可按堿基互補(bǔ)原則復(fù)性形成雜合雙鏈(heteroduplex)

，這一過程稱為雜交。現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

在雜交之前，通常用瓊脂糖凝膠分離待測(cè)的DNA分子，再將分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到特定的支持物上。由于轉(zhuǎn)移后各個(gè)DNA片段在膜上的相對(duì)位置與在凝膠中的相對(duì)位置一樣，故稱為印跡（blotting）。印跡（blotting）現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三（一）Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交。其基本過程是將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測(cè)DNA片段變性后，將凝膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針檢測(cè)待測(cè)的DNA。現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三探針（probe）

是指經(jīng)過特殊標(biāo)記的已知序列核苷酸片段，可以用來檢測(cè)某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段。

探針的種類

寡核苷酸基因組DNAcDNA片段

RNA片段標(biāo)記物

放射性同位素生物素?zé)晒馊玖?/p>

現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三Southern印跡雜交的基本步驟待測(cè)DNA樣品的限制性內(nèi)切酶消化

酶切DNA樣品的電泳分離凝膠中DNA的變性和Southern轉(zhuǎn)移

探針的制備

Southern雜交

雜交結(jié)果的檢測(cè)

現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三M1210×SSC

轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

基因組DNA的定性與定量分析。如對(duì)在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。Southertblotting用途現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三（二）Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術(shù)來檢測(cè)RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。

Northern印跡雜交基本原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測(cè)的分子是RNA，可用來對(duì)組織或細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行定性或定量分析。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三Northern印跡雜交的基本過程現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三相同點(diǎn)：名稱相對(duì)于Southernblotting轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法不同點(diǎn)原理均為毛細(xì)作用現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三Northernblotting用途

檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA

的表達(dá)水平。比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblotting)

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子之間存在相互作用的特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）上，再用相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。最常用的蛋白質(zhì)是抗體，因此被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術(shù)。

現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，蛋白質(zhì)的位置可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡相似之處現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的檢測(cè)以抗體作探針用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記第二抗體，底物顯色來檢測(cè)蛋白區(qū)帶的信號(hào)，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度。或用同位素標(biāo)記第二抗體，放射自顯影法檢測(cè)蛋白區(qū)帶的信號(hào)。與DNA和RNA印跡不同之處現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三Westernblotting應(yīng)用

檢測(cè)樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析蛋白質(zhì)分子的相互作用研究現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三三種印跡技術(shù)的比較Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三第2節(jié)

PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶鏈反應(yīng)現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

PCR技術(shù)是1985年由美國(guó)科學(xué)家KaryBMullis建立的體外擴(kuò)增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)，是分子生物學(xué)技術(shù)中一項(xiàng)具有革命性的創(chuàng)舉。

PCR方法被美國(guó)Science雜志評(píng)為1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被評(píng)選為象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、PCR技術(shù)的基本原理現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三二、PCR技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高3.簡(jiǎn)便快速4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三2.采用PCR方法獲得目的基因

引物選擇：特異引物、隨機(jī)引物、簡(jiǎn)并引物

1.采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因三、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的擴(kuò)增與克隆現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三（二）基因的體外定點(diǎn)突變（三）基因突變分析（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列測(cè)定三、PCR技術(shù)的主要用途現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去DNA鏈末端合成終止法Sanger1958年和1980年兩次獲Nobel獎(jiǎng)現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三DNA鏈末端合成終止法現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三DNA自動(dòng)測(cè)序用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記4種ddNTP，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離。通過4種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出4種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。

現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三四、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)（二）原位PCR技術(shù)(ISP)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)(realtimePCR)現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三RT-PCR技術(shù)AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三第3節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)

與基因剔除技術(shù)現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

是指將外源基因整合到動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞的基因組中并使外源基因在動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的技術(shù)。

基因的導(dǎo)入方式主要：

顯微注射法胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

即體細(xì)胞克隆技術(shù)，是用顯微操作、電融合等方法將動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)個(gè)體的去除細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成為個(gè)體。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

核轉(zhuǎn)移技術(shù)可使一個(gè)細(xì)胞變成一個(gè)個(gè)體，這樣產(chǎn)生的個(gè)體所攜帶的遺傳物質(zhì)與細(xì)胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一樣，是一種無性繁殖的過程，即克隆(clone)。現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三通過分子生物學(xué)的方法定向地敲除動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因的技術(shù)稱為基因剔除(geneknock-out)或基因打靶(genetargeting)。三、基因剔除技術(shù)現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動(dòng)物模型（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三第4

節(jié)

生物芯片技術(shù)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNAarray)cDNA芯片(cDNAchip)

指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。一、基因芯片(genechip)現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

將探針與熒光標(biāo)記的待測(cè)樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)雜交的熒光信號(hào)和強(qiáng)度，從而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。

現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)又稱蛋白質(zhì)陣列

(proteinarray)現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三基本原理：

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別和相互結(jié)合。如抗體與抗原或受體與配體之間的特異性結(jié)合。最常用的探針：

抗體，抗體與抗原結(jié)合的特異性最強(qiáng)。檢測(cè)方法：

標(biāo)記檢測(cè)法、直接檢測(cè)法現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三第5節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三1989年美國(guó)紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4分子的研究。轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)一、酵母雙雜交系統(tǒng)（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理N端C端現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三

這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有61頁(yè)\編輯于星期三（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1.分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作用及蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域2.篩選和發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)3.篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

4.繪制蛋白相互作用系統(tǒng)圖譜現(xiàn)在是54頁(yè)\一共