脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)在致病菌分型技術(shù)的應(yīng)用王宇【摘要】PulsedFieldGelElectrophoresis(PFGE)isanewtechniqueofgelelectrophoresisdevelopedin1980's.ItcanbeusedtoseparatelargeDNAmoleculesrangingfrom35to10Mb.Ithasbeenwidelyappliedtothepathogenmoleculartyp-ing,identificationofspeciesgroups,Source-trackingofpathogenandnosocomialinfectionsurveillance.%脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse-fieldgelelectrophoresis,PFGE),又稱(chēng)脈沖式交變電場(chǎng)電泳,該技術(shù)是將電泳電場(chǎng)方向交替性改變,并優(yōu)化脈沖時(shí)間和其他條件，可以分辨凝膠中35~10000kb的DNA分子.該方法應(yīng)用于分子流行病學(xué)中，通過(guò)觀察電泳條帶的差異，為確定菌株之間的親緣關(guān)系提供了可靠的技術(shù)手段.該技術(shù)在致病菌溯源(細(xì)菌性傳染性疾病溯源、細(xì)菌性食源性疾病溯源)、醫(yī)院內(nèi)感染流行監(jiān)測(cè)等方面都有廣泛的應(yīng)用.【期刊名稱(chēng)】《中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)》【年(卷)，期】2015(012)023【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P186-189)【關(guān)鍵詞】脈沖場(chǎng)凝膠電泳;致病菌分型;致病菌溯源;院感監(jiān)測(cè)【作者】王宇【作者單位】上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海200023【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】R378脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse-fieldgelelectrophoresis,PFGE),又稱(chēng)脈沖式交變電場(chǎng)電泳，是上世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一種新型的電泳技術(shù)，主要用來(lái)分離大分子量線性DNA。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能分離50kb以下的DNA分子，對(duì)于超過(guò)50kb的DNA分子，傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠其分子篩作用較弱，無(wú)法清晰分辨電泳條帶［3］。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)突破了該瓶頸，很好地解決了這一問(wèn)題。1984年，Schwartz和Cantor首次將脈沖場(chǎng)凝膠技術(shù)應(yīng)用于染色體DNA的分離，并成功分離到16條完整的釀酒酵母菌細(xì)胞染色體DNA。此后該技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，到目前為止，PFGE技術(shù)已經(jīng)可以分離高達(dá)10Mb級(jí)DNA分子［4］。PFGE技術(shù)因其所具備的高分辨能力，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，幾乎覆蓋所有生物基因組結(jié)構(gòu)的研究。國(guó)內(nèi)開(kāi)始應(yīng)用脈沖電場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)最早應(yīng)用于研究鼠疫耶爾森菌［5］，可見(jiàn)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)在致病菌分型上有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，適于推廣應(yīng)用。近年來(lái)，該技術(shù)不斷成熟，特別是限制性?xún)?nèi)切酶的應(yīng)用，使其成功應(yīng)用于菌株親緣關(guān)系的分析。通過(guò)對(duì)檢測(cè)儀器、試劑、操作程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)置，可以建立一套重復(fù)性好、分辨率高且數(shù)據(jù)可以共享的細(xì)菌分子分型方法，該方法已在流行病學(xué)調(diào)查和院內(nèi)感染分析中起到日益重要的作用。細(xì)菌以二分裂方式進(jìn)行增殖，在其不斷的傳代過(guò)程中，其親緣細(xì)菌之間具有相同的基因物質(zhì)。不同來(lái)源的致病菌中的基因物質(zhì)是否相似是鑒定其是否具有親緣關(guān)系的依據(jù)［6］。使用適宜的限制性?xún)?nèi)切酶，可以在4h內(nèi)將基因組DNA酶切成10~20個(gè)DNA大限制性片段，通過(guò)對(duì)這些片段的大小和數(shù)量進(jìn)行分析可以對(duì)DNA大分子進(jìn)行鑒定［7］。在正電場(chǎng)推動(dòng)下，瓊脂糖(或聚丙烯酰胺)凝膠以篩濾形式對(duì)大小不同的DNA分子起分離作用。DNA分子可看作自由牽引的卷體，只有在整個(gè)分子沿一系列膠孔運(yùn)行時(shí)，DNA的泳動(dòng)方能實(shí)現(xiàn)。較小的DNA分子可進(jìn)入較小的膠孔，大些的DNA分子只能進(jìn)入較大的膠孔，故需較長(zhǎng)時(shí)間才能找到可進(jìn)入的膠孔，因而泳動(dòng)軌跡彎曲，泳動(dòng)速度慢。>30kb的DNA分子在電泳時(shí)只能以頭尾牽引方式進(jìn)入膠孔，如同蛇行一般，凝膠濾過(guò)效應(yīng)不再起作用，從而也無(wú)法分離DNA。雖然通過(guò)降低凝膠濃度和電場(chǎng)強(qiáng)度可在一定程度上解決較大DNA分子的分離困難，但仍然無(wú)法解決大于150kbDNA分子的分離。PFGE技術(shù)與傳統(tǒng)電泳技術(shù)的最大區(qū)別就是其電泳電場(chǎng)可定期改變，且電場(chǎng)改變的方向和時(shí)間均可根據(jù)不同大小的DNA分子進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)電場(chǎng)方向改變時(shí)，不同大小的DNA分子重定向的時(shí)間與其分子大小成正比，隨著電場(chǎng)定期交替變化，不同大小的DNA分子以不同速度在凝膠上以蛇形軌跡泳動(dòng)，從而達(dá)到分離大分子DNA片段的目的。通過(guò)對(duì)電場(chǎng)方向、脈沖時(shí)間、凝膠濃度等條件的優(yōu)化，可以有效分離35-10Mb的DNA大分子［1］。2.1致病菌溯源常規(guī)的診斷方法是根據(jù)微生物的表型特征而進(jìn)行的，例如根據(jù)微生物對(duì)不同染料的染色性、生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)、抗原特性、藥敏實(shí)驗(yàn)、菌落特征、是否攜帶噬菌體、是否表達(dá)細(xì)菌素以及菌體蛋白成分等綜合指標(biāo)進(jìn)行判定，這些方法存在的一個(gè)共同問(wèn)題是，許多情況下只能鑒定某一類(lèi)病原微生物，屬于特異性診斷方法。病原微生物的生理、生化表型是由其所含的遺傳物質(zhì)決定的。表型的差異是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)差異的體現(xiàn)。直接研究細(xì)菌染色體DNA分子的特點(diǎn)，比較各種細(xì)菌DNA組成和結(jié)構(gòu)的差異與相似性，可從本質(zhì)上闡明細(xì)菌間的差別及親緣關(guān)系［2］。2.1.1細(xì)菌性傳染性疾病溯源傳染性疾病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的一類(lèi)疾病。人類(lèi)在自然科學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得許多令人矚目的成就，但在與傳染性疾病的抗?fàn)幹校詻](méi)有完全掌握這類(lèi)疾病發(fā)生的機(jī)理。在細(xì)菌性疾病方面，早期快速診斷和對(duì)菌株的鑒定是臨床實(shí)驗(yàn)室一直努力的目標(biāo)。對(duì)各種病原微生物建立快速的診斷和檢測(cè)方法是采取有效治療和應(yīng)對(duì)措施的重要前提。當(dāng)對(duì)一個(gè)未知的病原微生物采用某一特定的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)而未能得到預(yù)期結(jié)果時(shí)，容易造成治療上的延誤，尤其在公共突發(fā)性生物事件急需盡快做出準(zhǔn)確結(jié)論時(shí)，延誤將帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)和生命的損失。而PFGE可從本質(zhì)上闡明細(xì)菌間的差別及親緣關(guān)系，從而快速找到應(yīng)對(duì)方法及傳染源，為研制疫苗等防治提供有效信息，保護(hù)人群健康，減少經(jīng)濟(jì)損失，避免人群恐慌。如江西省疾病預(yù)防控制中心的熊長(zhǎng)輝醫(yī)生等利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)分析流行性腦脊髓膜炎（簡(jiǎn)稱(chēng)〃流腦”）病例及其密切接觸者分離出的腦膜炎奈瑟菌（Nm）的同源性以及不同病例分離出Nm的相關(guān)性。他們對(duì)6例疑似流腦病例的血液和腦脊液標(biāo)本以及對(duì)密切接觸者咽拭子進(jìn)行腦膜炎奈瑟菌的培養(yǎng)分離，分離菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、血清學(xué)分群鑒定、糖原利用試驗(yàn)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）鑒定試驗(yàn)結(jié)果6例疑似流腦病例與其密切接觸者共分離出21株菌，均為NmC群,5株為AH1型14株為AH2型2株為AH47型。結(jié)論，流腦病例分離出的Nm與其密切接觸者分離出的Nm完全同源，其中4例病例病原菌來(lái)自同一菌株［8］。2.1.2細(xì)菌性食源性疾病溯源目前，在世界范圍內(nèi)，細(xì)菌性食源性疾病仍然是人類(lèi)面臨的一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。特別是交通、物流、旅游行業(yè)的快速發(fā)展，細(xì)菌性食源性疾病的發(fā)病模式也有了較大的改變。以往，食源性疾病多以單一地區(qū)的集中爆發(fā)為主，現(xiàn)在食源性疾病更多以多地爆發(fā)或者表現(xiàn)為多地表面上的〃散發(fā)”。因此，在食源性疾病爆發(fā)或者“潛在”爆發(fā)的時(shí)候，應(yīng)對(duì)不同來(lái)源的病原體分子水平和基因物質(zhì)的水平上進(jìn)行鑒定以確定其親緣關(guān)系，并對(duì)具有同源性或親緣關(guān)系相近的致病菌開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查，確定傳播途徑并追蹤傳染源［7］。由于PFGE技術(shù)可以在分子水平上評(píng)估不同來(lái)源細(xì)菌的親緣關(guān)系，因此，在細(xì)菌性食源性疾病的溯源調(diào)查過(guò)程中，PFGE技術(shù)被廣泛應(yīng)用于判定可疑食品分離菌株、污染環(huán)境中分離菌株、病人嘔吐物或排泄物中分離菌株以及可疑傳染源分離菌株的同源性或親緣關(guān)系，成為細(xì)菌性食源性疾病溯源判定的金標(biāo)準(zhǔn)［9-10］。目前，多個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家都建立了基于PFGE技術(shù)的細(xì)菌分子分型網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，用于食源性疾病的防控。不同地區(qū)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)共享PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可以對(duì)不同來(lái)源菌株進(jìn)行同源性即時(shí)比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)潛在的食物中毒事件，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警，以便更即時(shí)的采取公共衛(wèi)生干預(yù)行動(dòng)。如浙江省寧波市傳染病院的的王春萍醫(yī)生、金春光醫(yī)生在2009年對(duì)來(lái)自食物中毒標(biāo)本中分離的沙門(mén)菌進(jìn)行分子分型。經(jīng)菌株分離、生化鑒定和血清型確定參照GB4789.4-2003方法進(jìn)行，對(duì)5株布利丹沙門(mén)菌用PFGE方法進(jìn)行分子分型，應(yīng)用QuantityoneTM分析軟件對(duì)電泳后的條帶進(jìn)行分析。結(jié)果：從7份標(biāo)本中檢出5株布利丹沙門(mén)菌，檢出率為71.4%,經(jīng)PFGE分型,5株來(lái)源于食物中毒病人標(biāo)本的布利丹沙門(mén)菌其帶型一致，因此PFGE型別相同［11］。美國(guó)于1998年5月建立PulseNet（病原菌分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)），是最早將PFGE技術(shù)應(yīng)用于食源性疾病監(jiān)測(cè)以及快速反應(yīng)和預(yù)警的國(guó)家，并有多起成功案例。在一起多州發(fā)生的食物中毒事件中，PulseNet通過(guò)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)多株致病菌具有相同的PFGE圖譜，CDC經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，最終確定多起可疑食物均來(lái)自于一家墨西哥農(nóng)場(chǎng)，通過(guò)對(duì)該農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)食物的控制和處理以及該農(nóng)場(chǎng)衛(wèi)生狀況的改善，從而在源頭上控制了該起食物中毒的爆發(fā)［7］。2.2在醫(yī)院內(nèi)感染流行監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用引起院內(nèi)感染暴發(fā)的微生物具有克隆相關(guān)性，即它們擁有相同的起源。克隆相關(guān)菌株具有相同的毒力、生化特性和基因相似性特征。由于微生物在種屬水平上存在著變異，分離自不同時(shí)間、不同地點(diǎn)、不同部位的細(xì)菌常被分為不同的型或亞型。分型對(duì)于鑒別感染流行、鑒定交叉感染、確定感染來(lái)源、識(shí)別特殊毒力株、指導(dǎo)實(shí)施免疫計(jì)劃有著非常重要的意義。將PFGE用于細(xì)菌感染流行病學(xué)研究，可以分析細(xì)菌較大的基因組DNA片段，能將整個(gè)細(xì)菌基因組的酶切片段圖譜清楚地顯現(xiàn)于一塊凝膠上，且重復(fù)性極好，具有很高的特異性和分辨力，能夠較好反映流行病學(xué)相關(guān)性，是公認(rèn)的醫(yī)院感染調(diào)查最好的分型方法，它能有效地協(xié)助查清感染來(lái)源，發(fā)現(xiàn)流行傳播方式，及時(shí)有效地控制流行，指導(dǎo)臨床治療，是一種快速、可靠、準(zhǔn)確的院內(nèi)感染細(xì)菌的流行病學(xué)調(diào)查方法［12-14］。如上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科的陳海紅醫(yī)生等對(duì)醫(yī)院2007—2008年以及2005年上半年下呼吸道標(biāo)本分離的耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）復(fù)活后，采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行基因同源性分析。其PFGE圖譜分析發(fā)現(xiàn),2007—2008年所復(fù)活的63株細(xì)菌中共有A、C-L等11種基因型，主要為流行株C和流行株￡各有20株，各占31.7%；此時(shí)期，外科重癥監(jiān)護(hù)病房（SICU）分離的25株CRAB主要來(lái)源于流行株C（72.0%），該病區(qū)中流行株C最早分離于2007年12月，之后在2008年引起持續(xù)而頻繁的感染；急診重癥監(jiān)護(hù)病房（EICU）分離的細(xì)菌以流行株G1為主（40.0%），呼吸科病房及留院觀察室均以克隆株E為主；SICU2005年2—6月分離的CRAB有A和B兩種基因型,以流行株B為主，占80.0%；克隆株A首次分離于2005年2月的SICU的痰標(biāo)本，之后（2007—2008年）在所研究的各個(gè)病區(qū)間斷出現(xiàn)。結(jié)論近兩年醫(yī)院CRAB主要的PFGE基因型為流行株C和流行株E,克隆株G1和克隆株E可引起暴發(fā)流行；同一克隆株可在同一病房?jī)?nèi)發(fā)生交叉感染從而引起流行暴發(fā)；流行相關(guān)的克隆株可在病區(qū)長(zhǎng)期生存，從而引起病區(qū)內(nèi)持續(xù)感染，需要積極采取感染控制措施；與2005年相比，近兩年SICU中的主要流行株由克隆株B變?yōu)榭寺≈闏,推測(cè)同一個(gè)病區(qū)的流行基因型可能存在流行變遷［15］。雖然PFGE方法得到了廣泛的應(yīng)用，但其自身也存在著一些不足之處。比如儀器設(shè)備、耗材以及數(shù)據(jù)庫(kù)分析軟件價(jià)格昂貴，不利于推廣；實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，技術(shù)不易掌握；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)（2~4d）,錯(cuò)過(guò)流行學(xué)調(diào)查最佳時(shí)機(jī)。由于PFGE方法是對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段條帶的帶型進(jìn)行區(qū)分，其分辨力和精確性不足，可能會(huì)導(dǎo)致某些流行病學(xué)上無(wú)相關(guān)的菌屬間由于具備相同的內(nèi)切酶位點(diǎn)而表現(xiàn)出相同的PFGE圖譜［3］,相對(duì)于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）、重復(fù)序列PCR技術(shù)（Rep-PCR）、多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）、IS200分型等方法，還存在一些局限性［16-17］。盡管該技術(shù)還存在著一定的不足之處，目前其在細(xì)菌分子分型領(lǐng)域仍然是最推崇的方法之一。自1984年脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的完善，得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。為病原微生物致病機(jī)制、分子流行病學(xué)和基礎(chǔ)科學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)，也將會(huì)在未來(lái)的研究中得到更好的加強(qiáng)，在技術(shù)和成本上不斷更新進(jìn)步，使其更好地應(yīng)用于相關(guān)的研究領(lǐng)域。【相關(guān)文獻(xiàn)】吳冠蕓，方福德.基因診斷技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1992:199.翟朝陽(yáng)，楊魯川.生物分子實(shí)驗(yàn)教材實(shí)驗(yàn)[M].成都：四川大學(xué)出版社，2006(8):48.邵化,常勝合，田雙起，等.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)及應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(35)：15361-15363.BASIME，BASIMH.Puls-fieldge1dectrophoresis(PFGE)techniqueanditsuseinmolecularbiology[J].TurkJBiol,2001(25):405-418.李軼華，劉小倩.脈沖電場(chǎng)凝膠電泳的原理及在微生物研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)地方病雜志，1996,6(6):354-355.SamirP,eta1.Useofpulsed-fieldgelelectrophoresisformolecularepidemiologicandpopulationgeneticstudiesofMycobacteriumtuberculosis[J].JClinMicrobiol,1999(6):1927-1931.李燕俊.沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)及其在致病菌研究中的應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2005,32(5):305-309.熊長(zhǎng)輝，楊夢(mèng)，袁輝，等.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)用于腦膜炎奈瑟菌的研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010(7):695-696.LukinmaaS,eta1.MolecularepidemiologyofClostridiumperfringensrelatedtofood-borneoutbreaksofdiseaseinFinlandfrom1984to1999[J].ApplEnvironMicrobiol,2002(8):3744-3749.MaryE,etal.FourstrainsofEscherichiacoliO157:H7isolatedfrompatientsduringanoutbreakofdiseaseassociatedwithgroundbeef:importanceofevaluatingmultiplecoloniesfromanoutbreak-associatedproduct[J].JClinMicrobiol,2002(4):1530-1533.王春萍，金春光.脈沖場(chǎng)凝膠電泳在沙門(mén)菌食物中毒的溯源[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009(1):116-117,158.陳衛(wèi)東，李麗.分子生物學(xué)方法在醫(yī)院感染監(jiān)控中的應(yīng)用