分子克隆醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)基礎(chǔ)1第五章分子克隆重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是按照人的意愿、在體外對(duì)DNA分進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝。克隆(clone)是指通過(guò)無(wú)性繁殖過(guò)程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。2載體和目的基因的分離；載體和目的基因的切斷；載體和目的基因的重組；重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增；重組DNA的篩選和鑒定。第一節(jié)基因工程技術(shù)路線(xiàn)3工具酶：指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶第二節(jié)分子克隆常用的工具酶5工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第二節(jié)分子克隆常用的工具酶6一、限制性?xún)?nèi)切酶

○酶有幾千種，分為6大類(lèi)：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、連接酶。

○基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修飾酶、聚合酶等水解酶分為內(nèi)切酶和外切酶

○內(nèi)切酶在核酸鏈內(nèi)部切割，生成寡核苷酸；外切酶從核酸鏈的末端開(kāi)始，漸進(jìn)式地水解核酸鏈，逐漸釋放單核苷酸。第二節(jié)分子克隆常用的工具酶7Ⅲ型限制酶有特定的識(shí)別序列切割位置在識(shí)別序列3’端相距20bp處，可以產(chǎn)生各種類(lèi)型的單鏈末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但總體來(lái)說(shuō)，用途不大。第二節(jié)分子克隆常用的工具酶9Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的識(shí)別序列而且其切割位點(diǎn)就在識(shí)別序列內(nèi)部基因工程中用途最廣識(shí)別序列是對(duì)稱(chēng)的，在一條鏈中從5’到3’方向的序列與其互補(bǔ)鏈從5’到3’方向的序列完全相同，稱(chēng)為回紋對(duì)稱(chēng)序列(palindrome)。第二節(jié)分子克隆常用的工具酶10限制性?xún)?nèi)切酶的命名屬名＋種名＋菌株類(lèi)型＋發(fā)現(xiàn)的順序第二節(jié)分子克隆常用的工具酶11第二節(jié)分子克隆常用的工具酶13EcoRI酶切不同來(lái)源的DNA及退火重組第二節(jié)分子克隆常用的工具酶14第二節(jié)分子克隆常用的工具酶15同尾酶：即識(shí)別序列不同，但酶切后產(chǎn)生同樣的黏性末端的兩種酶。同裂酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，但在切點(diǎn)位置上對(duì)甲基化堿基的敏感性不同。第二節(jié)分子克隆常用的工具酶17第二節(jié)分子克隆常用的工具酶18限制性?xún)?nèi)切酶的主要用途○重組DNA分子

匹配末端的連接：同一種酶切割不同DNA分子產(chǎn)生相同的突出末端；或不同酶切割不同DNA分子產(chǎn)生相同的突出末端，可在連接酶作用下連接為重組DNA分子。

平端連接：可直接連接，但效率較低。

不匹配黏端的連接：先補(bǔ)平(Klenow)或修平(S1)后再連接。

繪制物理圖譜（限制性?xún)?nèi)切酶圖譜）第二節(jié)分子克隆常用的工具酶19DNA連接酶大腸桿菌NADT4噬菌體ATP來(lái)源輔基第二節(jié)分子克隆常用的工具酶21DNA連接酶功能1.修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。2.修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵。3.連接多個(gè)平頭DNA雙鏈分子。第二節(jié)分子克隆常用的工具酶22從分子動(dòng)力學(xué)的角底講，由限制性?xún)?nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末瑞則屬于分子間的連接，因此后者速度要慢的多。第二節(jié)分子克隆常用的工具酶23缺口前移標(biāo)記法制備32P標(biāo)記的探針NicktranslationDNA聚合酶功能第二節(jié)分子克隆常用的工具酶25DNA聚合酶Ⅰ大片段

基本性質(zhì)大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。

具有：5`-3`DNA聚合酶活性

3`-5`核酸外切酶活性失去5`-3`核酸外切酶活性第二節(jié)分子克隆常用的工具酶26T4-DNA聚合酶功能

切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)的的3`粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記

第二節(jié)分子克隆常用的工具酶29反轉(zhuǎn)錄酶

reversetranscriptase以RNA為模板，聚合形成cDNA鏈。2.雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈第二節(jié)分子克隆常用的工具酶30核酸酶S1可以降解單鏈DNA和RNA。降解單鏈DNA比降解雙鏈DNA快75000倍。降解單鏈DNA比降解單鏈RNA快7倍。反應(yīng)最適pH范圍為4.0-4.3.第二節(jié)分子克隆常用的工具酶31核酸酶S1功能

內(nèi)切單鏈DNA或RNA內(nèi)切帶缺口或裂口的雙鏈DNA或RNA第二節(jié)分子克隆常用的工具酶32末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶

來(lái)自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTP第二節(jié)分子克隆常用的工具酶33堿性磷酸酶

來(lái)自小牛胸腺（CAP）來(lái)自大腸桿菌（BAP）功能：將DNA或RNA片段的5`端的磷酸基切除第二節(jié)分子克隆常用的工具酶34第三節(jié)分子克隆常用的載體為了能夠在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，必須將DNA片段連接到一種特定的、具有自我復(fù)制能力的DNA分子上。這種DNA分子就是基因工程載體（vector）。載體的本質(zhì)是DNA（少數(shù)為RNA）。質(zhì)粒（plasmid）

λ噬菌體的衍生物動(dòng)物病毒細(xì)菌人工染色體酵母人工染色體35載體應(yīng)具備的條件能在宿主細(xì)胞中大量復(fù)制，得到大量的重組DNA分子載體上的內(nèi)切酶位點(diǎn)對(duì)于一種酶來(lái)說(shuō)只能有一個(gè)（置換型載體上被置換片段的兩側(cè)各有一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)）克隆載體要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體要有啟動(dòng)子載體上要有報(bào)告基因或選擇標(biāo)記基因在不影響載體復(fù)制和表達(dá)的DNA序列上有內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)具有較高的外源DNA裝載能力。第三節(jié)分子克隆常用的載體36克隆載體——克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大增加表達(dá)載體——將外源基因或DNA片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)插入型載體—將外源基因或DNA插入其中置換型載體—切除載體部分DNA，代之以外源基因或DNA。第三節(jié)分子克隆常用的載體37質(zhì)粒質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主細(xì)胞染色體外而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子。絕大多數(shù)質(zhì)粒是DNA型的，天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA。基因克隆的載體質(zhì)粒DNA分子都具有復(fù)制子、選擇性標(biāo)記、克隆位點(diǎn)。第三節(jié)分子克隆常用的載體38質(zhì)粒的命名小寫(xiě)p代表質(zhì)粒（plasmid），后接兩個(gè)大寫(xiě)字母代表發(fā)現(xiàn)者或?qū)嶒?yàn)室，字母右方數(shù)字代表質(zhì)粒的編號(hào)。pBR322質(zhì)粒F.BovlivarR.L.Rodriguez編號(hào)第三節(jié)分子克隆常用的載體39質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系（1）質(zhì)粒對(duì)宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主細(xì)胞中，既不殺傷細(xì)胞，對(duì)宿主的代謝活動(dòng)也無(wú)影響，宿主離開(kāi)質(zhì)粒照樣的生存下去。（2）質(zhì)粒離開(kāi)宿主就無(wú)法生存，只有依賴(lài)宿主細(xì)胞的（酶和蛋白質(zhì)）幫助，才能完成自身的復(fù)制（擴(kuò)增）、轉(zhuǎn)錄。（3）質(zhì)粒經(jīng)常為宿主執(zhí)行一些適當(dāng)?shù)倪z傳功能，作為對(duì)宿主細(xì)胞的補(bǔ)償（“交房租”）。（4）質(zhì)粒賦于宿主各種有利的表型（質(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)或酶），使宿主獲得生存優(yōu)勢(shì)，與我們基因工程實(shí)驗(yàn)緊密相關(guān)的，如抗生素抗性基因：第三節(jié)分子克隆常用的載體40質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)和研究意義1）理論意義質(zhì)粒能夠復(fù)制、傳遞和表達(dá)遺傳信息，從分子遺傳學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看是一種有機(jī)體，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一塊體重要基石。

2）實(shí)踐意義是基因工程的重要載體（vector），能把外源基因（目的基因）送到宿主細(xì)胞中去克隆擴(kuò)增或克隆表達(dá)。質(zhì)粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任務(wù)之一就是嚴(yán)格改造質(zhì)粒的同時(shí)，控制質(zhì)粒不傳遞，若一個(gè)致癌質(zhì)粒可以傳遞就會(huì)傳到處都是。

第三節(jié)分子克隆常用的載體41質(zhì)粒的分類(lèi)1.按質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)理，分為2類(lèi)：1）嚴(yán)謹(jǐn)控制型（stringentcontrdtype）2）松弛控制型（relaxedcontroltype）(1)拷貝數(shù)少，一般<10個(gè)，分子量大；(1)拷貝數(shù)多，10-200個(gè)，分子量小；(2)復(fù)制受限，受細(xì)菌宿主DNA復(fù)制系(2)復(fù)制不受細(xì)菌DNA復(fù)制系統(tǒng)限制，統(tǒng)的控制；當(dāng)宿主蛋白質(zhì)合成受抑制(3)特點(diǎn)是這類(lèi)質(zhì)粒可以自傳遞；時(shí)（如培養(yǎng)中加入氯霉素時(shí)），其拷貝(4)嚴(yán)謹(jǐn)控制機(jī)理（低拷貝原因），認(rèn)數(shù)可猛增至1000-3000之多，該性質(zhì)對(duì)為是該質(zhì)粒可以產(chǎn)生阻逼蛋白，反饋基因工程技術(shù)十分有利。抑制自身DNA合成。3）分子量小，不具備自傳遞能力；4）基因工程使用松弛型（高拷貝數(shù)）質(zhì)粒，以獲得列多的基因產(chǎn)物。第三節(jié)分子克隆常用的載體422.按分子量大小，分為2類(lèi)1）小型質(zhì)粒，<15kb2)大型質(zhì)粒>15kb小型質(zhì)粒，無(wú)接合和自傳遞能力，在接多屬接合型或自傳遞型，大型質(zhì)粒只合質(zhì)粒協(xié)助也能轉(zhuǎn)移，也可心通過(guò)轉(zhuǎn)化能通過(guò)細(xì)菌的接合作用由一個(gè)細(xì)菌作用進(jìn)入受體細(xì)胞，這類(lèi)質(zhì)粒種類(lèi)較多，傳到另一個(gè)細(xì)菌。（如F質(zhì)粒）。幾乎每種細(xì)菌都可以含有2種以上，基因工程一般用小型質(zhì)粒。第三節(jié)分子克隆常用的載體433.按質(zhì)粒轉(zhuǎn)移方式，分為3類(lèi)1）接合型質(zhì)粒（conjugaativeplasmid）帶有效接觸基因質(zhì)粒，只能使細(xì)菌接合，本身不被傳遞.2）可移動(dòng)質(zhì)粒（mobiliableplasmid）可以被傳遞，但不能使細(xì)菌接合。3)自傳遞質(zhì)粒（selftranmissibleplasmid）兼具1）2）兩種功能因而可以自傳遞，如F質(zhì)粒。

第三節(jié)分子克隆常用的載體44質(zhì)粒的功能質(zhì)粒的功能主要通過(guò)質(zhì)粒本身攜帶的基因編碼蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來(lái)。攜帶質(zhì)粒的宿主細(xì)胞可表現(xiàn)出相應(yīng)表型。1.性質(zhì)粒即細(xì)菌F質(zhì)粒，它本身轉(zhuǎn)到F-宿主細(xì)胞時(shí)，使后者變成F+，改變宿主細(xì)菌性別。2.抗生素抗性抗藥性（R）質(zhì)粒使細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性，這種抗藥性抗性基因也可以轉(zhuǎn)移到缺乏這種抗藥基因的細(xì)菌體內(nèi)，使之產(chǎn)生抗藥性。3.產(chǎn)生毒素的質(zhì)粒如col質(zhì)粒能產(chǎn)生大腸桿菌素因子（colicin），殺死不含該毒素的親緣細(xì)菌。第三節(jié)分子克隆常用的載體45質(zhì)粒的基本特性

1.自主復(fù)制質(zhì)粒的復(fù)制是自主調(diào)節(jié)的，不受染色體復(fù)制調(diào)節(jié)因素的影響。

復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)由質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)（ori），質(zhì)粒的rep基因和cop基因組成。Rep蛋白啟動(dòng)質(zhì)粒的復(fù)制，cop基因本身或其表達(dá)產(chǎn)物可抑制復(fù)制作用，從而控制質(zhì)的拷貝數(shù)。

2.質(zhì)粒的不相容性利用相同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒不能共存于同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。PMB和COLEI是兩個(gè)密切相關(guān)的復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)，帶有PMB和COLEI復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)的質(zhì)粒是不相容的。但它們與帶有PSC101或P15A復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)是完全相容的，可以共存于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。不相容性使質(zhì)粒能夠很容易被克隆。

3.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性在自然條件下，在些質(zhì)粒可以通過(guò)細(xì)菌接合作用在細(xì)菌細(xì)胞間傳遞。基因工程中常用的質(zhì)粒載體缺乏轉(zhuǎn)移所需的基因（mob基因），不能通過(guò)接合作用在細(xì)胞間傳遞，但可采用人工方法轉(zhuǎn)化到細(xì)菌細(xì)胞中。第三節(jié)分子克隆常用的載體46質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)小、遺傳標(biāo)記不理想等缺點(diǎn)，不能滿(mǎn)足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。第三節(jié)分子克隆常用的載體47pSC101

一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1～2個(gè)拷貝,編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr）。pSC101質(zhì)粒不僅具有可插入外源DNA的多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點(diǎn)，而且還具有四環(huán)素抗性的強(qiáng)選擇記號(hào)，因此，它被選為第一個(gè)真核基因的克隆載體。當(dāng)然，這個(gè)質(zhì)粒載體也有其明顯的缺點(diǎn)，它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA，其產(chǎn)量就要比其它質(zhì)粒載體低得多。第三節(jié)分子克隆常用的載體48ColE1屬于松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。在正常生長(zhǎng)條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸被耗盡，或是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。此時(shí)，松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制達(dá)數(shù)小時(shí)之久，使每個(gè)寄主細(xì)胞中所累積的ColE1質(zhì)粒拷貝數(shù)增加到1000~3000個(gè)之多。由此可見(jiàn)，由于質(zhì)粒拷貝數(shù)高，插入的外源DNA片段的產(chǎn)量也就得到相應(yīng)的提高。第三節(jié)分子克隆常用的載體49pBR322pBR322質(zhì)粒是由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）；第三部分則來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量，不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來(lái)仍較為便利。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000~3000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。第三節(jié)分子克隆常用的載體50pUCpUC系列質(zhì)粒載體包括如下四個(gè)部分：

來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因;大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列;位于lacZ'基因中的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。第三節(jié)分子克隆常用的載體51pGEM-3ZpGEM-3Z是一種與pUC系列十分類(lèi)似的小分子質(zhì)粒載體，總長(zhǎng)度為2,743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ'基因。pGEM-3Z具有兩個(gè)來(lái)自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異性的識(shí)別位點(diǎn)。由于這兩個(gè)啟動(dòng)子分別位于lacZ'基因中多克隆位點(diǎn)區(qū)的兩側(cè)，故若在反應(yīng)試管中加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會(huì)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。第三節(jié)分子克隆常用的載體52大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體含有兩種分別來(lái)自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)與選擇標(biāo)記。它使研究工作者可以自如地在這兩種不同的寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因，并單獨(dú)或同時(shí)在兩種寄主細(xì)胞中研究目的基因的表達(dá)活性及其它調(diào)節(jié)功能。例如，可將酵母的某種基因亞克隆到穿梭質(zhì)粒載體上，置于大腸桿菌中進(jìn)行定點(diǎn)突變處理后，再把突變體基因返回到酵母細(xì)胞，以便在天然寄主中觀察研究此種突變的功能效應(yīng)。第三節(jié)分子克隆常用的載體53噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類(lèi)非細(xì)胞微生物，能高效特異性地轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定條件下上述兩種狀還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。λ噬菌體（20面體型）噬菌體M13（線(xiàn)狀體型）第三節(jié)分子克隆常用的載體54噬菌體◆λ噬菌體基因組全長(zhǎng)49kb。λ噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，位于兩端的為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，在基因庫(kù)篩選中，λ噬菌體作載體與細(xì)菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽(yáng)性克隆數(shù)多等特點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于各類(lèi)基因庫(kù)的構(gòu)建。第三節(jié)分子克隆常用的載體55噬菌體的生命周期溶菌周期：是指噬菌體吸附到寄主細(xì)胞表面后，注入DNA進(jìn)行復(fù)制及蛋白質(zhì)的合成，并組裝成子代噬菌體顆粒，最后使寄主細(xì)胞破裂，釋放出子代噬菌體顆粒。溶原周期：是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。DNA重組技術(shù)一般要使噬菌體進(jìn)入溶菌周期。第三節(jié)分子克隆常用的載體56λ-DNA載體的構(gòu)建野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高其裝載量。其實(shí)野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所必需的，要據(jù)切除的多少，可分為插入型載體和取代型載體兩大類(lèi)。第三節(jié)分子克隆常用的載體57插入型載體免疫失活型imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記的基因λ-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。β-半乳糖苷酶失活型LacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到LacZ基因中，基因滅活，不能生成藍(lán)色化合物，而空載體裁λ-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。58第三節(jié)分子克隆常用的載體替換型載體中具有可取代的EcoRI片段，內(nèi)編碼有SupE基因。這個(gè)噬菌體能校正寄主細(xì)胞的LacZ基因的琥珀突變。由于這種噬菌體的感染，寄主細(xì)胞LacZ基因的琥珀突變被抑制，所以能在乳糖麥康基氏瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色的噬菌斑，或是在X-ga1瓊脂培基上產(chǎn)生藍(lán)色的噬菌斑。但如果具有SupE基因的EcoRI片段被外源DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體在上述的兩種指示培養(yǎng)基中都只能產(chǎn)生出無(wú)色的噬菌斑。取代型載體59Cosmid質(zhì)粒黏性質(zhì)粒（Cosmid）：一種用基因工程技術(shù)組建的特殊的大腸桿菌質(zhì)粒，包含噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)質(zhì)粒的DNA順序。抗藥性標(biāo)記復(fù)制原點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶酶位點(diǎn)

Cos位點(diǎn)第三節(jié)分子克隆常用的載體60◆柯斯質(zhì)粒(cosmid)是利用部分λ噬菌體DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的。柯斯質(zhì)粒具有λ噬菌體的cos序列(12bp)和細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)。cos序列是噬菌體DNA包裝成噬菌體時(shí)所必需的，而質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)可使柯斯質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中同普通細(xì)菌質(zhì)粒一樣自主復(fù)制。柯斯質(zhì)粒也具有抗生素抗性基因◆可接受長(zhǎng)達(dá)50kb的外源DNA片段，這在克隆真核生物基因中十分有用，因?yàn)橐粋€(gè)DNA片段就可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。還與YAC克隆系統(tǒng)結(jié)合，用于基因作圖分析。第三節(jié)分子克隆常用的載體61第三節(jié)分子克隆常用的載體用限制性?xún)?nèi)切酶處理質(zhì)粒和噬菌體，再將cos位點(diǎn)拼接到質(zhì)粒上再酶切位點(diǎn)將重組質(zhì)粒線(xiàn)形化，再插入相應(yīng)的基因組DNA

通過(guò)含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)平板篩選存活的細(xì)胞可能含有相應(yīng)的重組質(zhì)粒62應(yīng)用Cosmid作載體進(jìn)行基因克隆的一般程序穿梭載體(shuttlevectors)是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體。因此，這類(lèi)載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列(Autonomouslyreplicatingsequence,ARS)以及選擇標(biāo)記性狀，具有多克隆位點(diǎn)。通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。穿梭載體第三節(jié)分子克隆常用的載體63BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制的質(zhì)粒，約100kb，它能在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1000kb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，尤其是重復(fù)序列多的DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，如由小F質(zhì)粒構(gòu)建的載體pBeloBAC11全長(zhǎng)7.4kb，僅帶有自我復(fù)制、控制拷貝數(shù)(repE)及質(zhì)粒分配(parE，parA,parB)所必須的最少序列。BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)，還有T7及SP6啟動(dòng)子位點(diǎn)，用于制備RNA分子，進(jìn)一步分析克隆的基因表達(dá)，作為染色體步行的探針，以及序列測(cè)定克隆的片段。細(xì)菌人工染色體第三節(jié)分子克隆常用的載體64酵母人工染色體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）是另一類(lèi)酵母穿梭載體。同YEp載體一樣具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類(lèi)基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類(lèi)人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。第三節(jié)分子克隆常用的載體65原核表達(dá)載體的構(gòu)建為了使克隆基因獲得正確表達(dá)，轉(zhuǎn)譯功能性蛋白，在目的基因與載體重組連接時(shí)，目的基因編碼的方向必須與載體DNA啟動(dòng)子方向相同，并要保持目的基因轉(zhuǎn)譯的相位不產(chǎn)生錯(cuò)誤，保持原有的閱讀框架，才能正確轉(zhuǎn)譯成氨基酸序列正確的功能蛋白。第三節(jié)分子克隆常用的載體66為確保原核細(xì)胞可識(shí)別被克隆的真核基因，應(yīng)采用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，且必須置于該基因的上游鄰近處，于該基因的下游還應(yīng)設(shè)置強(qiáng)終止子，基因的兩側(cè)應(yīng)有不同的限制性酶切位點(diǎn)，以便定向插入，同時(shí)還應(yīng)具有標(biāo)記基因以便克隆選擇。表達(dá)載體在E.coli表達(dá)動(dòng)物或植物基因P起動(dòng)子R核糖體結(jié)合位點(diǎn)T終止子第三節(jié)分子克隆常用的載體67原核細(xì)胞表達(dá)載體的類(lèi)型非融合型pKK223-3結(jié)構(gòu)分泌型PINⅢ-ompA1結(jié)構(gòu)

融合蛋白表達(dá)載體pGEX結(jié)構(gòu)包涵體型pBV220結(jié)構(gòu)融合蛋白表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體包涵體型表達(dá)載體第三節(jié)分子克隆常用的載體68真核細(xì)胞表達(dá)載體的種類(lèi)載體的類(lèi)型質(zhì)粒型載體病毒載體整合型表達(dá)載體游離型表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)載體穩(wěn)定性表達(dá)

非復(fù)制型表達(dá)載體細(xì)胞裂解型表達(dá)載體第三節(jié)分子克隆常用的載體69幾種常用的真核表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus，RV）載體是目前唯一的RNA病毒載體，在鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鳥(niǎo)類(lèi)的脾壞死病毒(SNV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、鼠類(lèi)的乳腺瘤病毒(MMTV)等。第三節(jié)分子克隆常用的載體70痘類(lèi)病毒載體痘苗病毒可不依賴(lài)宿主細(xì)胞，獨(dú)立于細(xì)胞質(zhì)中（而不在核中）進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，無(wú)致癌性。第三節(jié)分子克隆常用的載體71HSV-I單純瘡疹病毒載體是一類(lèi)雙鏈DNA病毒，有80個(gè)以上基因，其中以HSV-I型備受關(guān)注。HSV-I基因組較大，可達(dá)150kb，許多基因均可缺失，但病毒仍有復(fù)制能力，因此為大片段外源基因的插入提供了條件，且插入容量大，至少可插入30kb的外源基因。第三節(jié)分子克隆常用的載體72真核細(xì)胞中的克隆載體在酵母細(xì)胞中常用的克隆載體在大腸桿菌中表達(dá)，具有較高的拷貝數(shù)具有遺傳標(biāo)記具有限制酶切位點(diǎn)根據(jù)復(fù)制方式不同：整合型（YIP）、復(fù)制型（YRP）

、附加體型（YEP）

。第三節(jié)分子克隆常用的載體73動(dòng)物細(xì)胞基因克隆載體SV40病毒是一種小型20面體的蛋白質(zhì)顆粒，由VPl、VP2、vP3三種病毒外殼蛋白構(gòu)成，中間包裝著一條環(huán)形的病毒基因組DNA。第三節(jié)分子克隆常用的載體74第三節(jié)分子克隆常用的載體取代型的重組病毒載體重組的病毒—質(zhì)粒載體75第四節(jié)目的基因的分離和克隆目的基因的應(yīng)用：研究基因的全貌和內(nèi)涵。探索疾病發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。研究生物物種的進(jìn)化與相關(guān)同源性分析。利用基因重組技術(shù)制備基因藥物。改良品種，生產(chǎn)新型生物活性物質(zhì)。基因診斷和基因治療。基因工程或DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因。76第四節(jié)目的基因的分離和克隆獲取外源目的基因的途徑：直接分離目的基因通過(guò)化學(xué)合成法和PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增法（又稱(chēng)酶促合成法）獲得基因。通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，從中篩選目的基因。77第四節(jié)目的基因的分離和克隆

用限制酶切斷成許多片段直接分離基因——鳥(niǎo)槍法將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。

該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。78第四節(jié)目的基因的分離和克隆化學(xué)合成法根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。79第四節(jié)目的基因的分離和克隆小片段粘接法：分別合成堿基12-15的單鏈DNA小片段，再通過(guò)T4-DNA連接酶連接。補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分另合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段及20-30堿基長(zhǎng)的單鏈中片段，再通過(guò)Klenow聚合酶及鏈接酶合成。大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段，再通過(guò)Klenow聚合酶及鏈接酶合成。80以DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板,利用酶促反應(yīng)（Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的4種dNTP由引物沿模板從5’→3’按堿基配對(duì)原則,形成與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)25-30個(gè)循環(huán)產(chǎn)物呈2n指數(shù)擴(kuò)增，由pg—μg（紫外可見(jiàn)），可獲得基因片段。第四節(jié)目的基因的分離和克隆酶促合成法（PCR擴(kuò)增法）81由TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3`端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴(lài)型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門(mén)aqDNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基存，克隆時(shí)即可采取TdT末端同聚尾的方法與載體連接，也可使用專(zhuān)門(mén)的T載體克隆。第四節(jié)目的基因的分離和克隆82從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法將DNA降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱(chēng)為基因組DNA文庫(kù)。如果這個(gè)文庫(kù)足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫(kù)，能從這文庫(kù)中釣取該生物的全部基因或DNA序列。基因組文庫(kù)（GenomicDNALibrary）第四節(jié)目的基因的分離和克隆83基因組文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程第四節(jié)目的基因的分離和克隆⑴分離純化基因組DNA：提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA⑵制備全部基因組的DNA片斷①機(jī)械斷裂法：用超聲波或高速攪拌DNA溶液，斷裂片段兩端沒(méi)有與克隆載體匹配的粘末端,因此插入載體之前還需要進(jìn)行修飾加工，少用②限制性?xún)?nèi)切酶降解（鳥(niǎo)槍法）過(guò)去用EcoRⅠ,現(xiàn)在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過(guò)的載體連接。84第四節(jié)目的基因的分離和克隆⑶DNA片斷與載體的連接包裝常用載體：粘性質(zhì)粒、λ噬菌體、酵母人工染色體①基因組DNA+粘性質(zhì)粒——重組DNA——轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落②基因組DNA+λ噬菌體——重組DNA—包裝成噬菌體——感染細(xì)菌噬菌斑1個(gè)克隆含有基因組的某個(gè)片段，整個(gè)克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。（4）目的基因的篩選特殊蛋白的編碼基因（抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）正選擇篩選（抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）85cDNA是指以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補(bǔ)，稱(chēng)為互補(bǔ)DNA或cDNA。cDNA文庫(kù)：提取出組織細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。實(shí)際為不包含內(nèi)含子的基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)第四節(jié)目的基因的分離和克隆86第四節(jié)目的基因的分離和克隆cDNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)以成熟mRNA為模板合成的cDNA無(wú)內(nèi)含子，每個(gè)基因的cDNA長(zhǎng)度較基因組基因大為減小，使操作更為方便。從cDNA文庫(kù)中篩選某一特定功能基因工作量較小。某一特定功能基因在mRNA中拷貝數(shù)大于基因組中的拷貝數(shù)，利于獲得較多的模板。可從全長(zhǎng)cDNA序列中直接找到基因編碼區(qū)，推測(cè)蛋白質(zhì)的氨基因順序，分析其性質(zhì)及功能等。基因克隆后可在原核細(xì)胞（大腸桿菌）中表達(dá)有生物活性的蛋白。87第四節(jié)目的基因的分離和克隆cDNA文庫(kù)的構(gòu)建程序1.制備mRNA

1)取材：mRNA約占總RNA的1－5％，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達(dá)最豐富的組織細(xì)胞為材料來(lái)源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島β細(xì)胞為原始生物材料，細(xì)胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為材料2)從總的RNA中分離mRNA將提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸[oligo(dT)]纖維素中進(jìn)行親和層析

88第四節(jié)目的基因的分離和克隆2.第一股cDNA合成

以O(shè)ligo(dT)為引物：從模板3’末端開(kāi)始，沿模板的3’→5’方向合成,對(duì)于較長(zhǎng)的mRNA分子很難得到全長(zhǎng)cDNA2）隨機(jī)引物：以6～8個(gè)核苷酸為隨機(jī)引物，從mRNA的不同結(jié)合點(diǎn)合成全長(zhǎng)cDNA第一鏈（RNA-DNA）

89第四節(jié)目的基因的分離和克隆3.第二股cDNA的合成

自身引導(dǎo)法：獲得的cDNA5`端會(huì)有幾對(duì)堿基丟失。置換合成法：獲得的cDNA5`端會(huì)也會(huì)有幾對(duì)堿基丟失。引導(dǎo)合成法：獲得的cDNA5`端能保留完整的序列。

自身引導(dǎo)法置換合成法引導(dǎo)合成法904.構(gòu)建cDNA文庫(kù)cDNA加接頭或銜接頭（加尾反應(yīng)）雙鏈cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細(xì)胞5.篩選目的基因核酸雜交法免疫結(jié)合法第四節(jié)目的基因的分離和克隆91第五節(jié)基因工程受體目的基因能否有效地導(dǎo)入受體細(xì)胞，取決于是否選用合適的受體細(xì)胞、合適的克隆載體和合適的基因轉(zhuǎn)移方法．

受體細(xì)胞—從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源基因并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞．原核生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞可以作為受體細(xì)胞，但不是所有細(xì)胞都可以作為受體細(xì)胞。92第五節(jié)基因工程受體經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后易接納重組DNA分子對(duì)載體的復(fù)制、擴(kuò)增、表達(dá)無(wú)嚴(yán)格限制無(wú)特異性降解外源DNA的酶系統(tǒng)不會(huì)對(duì)外源DNA分子進(jìn)行修飾能表達(dá)由重組子提供的某種表型特征利于轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件：93感受態(tài)細(xì)胞：指具備接受外源DNA能力的宿主細(xì)胞。大腸桿菌：生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定。適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的建立，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌。酵母菌：具有真核生物的特征生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定。適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的建立、真核生物基因表達(dá)的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌。哺乳動(dòng)物細(xì)胞：與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)完善，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)條件苛刻。適用于哺乳動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體。第五節(jié)基因工程受體在基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、動(dòng)植物細(xì)胞等，且受體細(xì)胞常常應(yīng)處于感受態(tài)的細(xì)胞。94DNA的體外重組（切、接）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和篩選（轉(zhuǎn)、增）轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程95一、DNA分子的體外連接黏性末端DNA片段的連接DNA連接酶能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。應(yīng)用DNA連接酶可在體外將具有黏性末端的DNA限制片段，插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，從而可能按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。EcoRI消化質(zhì)粒和外源DNA形成的重組體第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程96同種限制性?xún)?nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的連接第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換97平末端DNA片段的連接

T4DNA連接酶法同聚物加尾法化學(xué)合成的銜接物連接DNA分子

第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程98同聚物加尾法應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账峒拥紻NA分子單鏈延伸末端的3`-OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴。需用5`特異的核酸外切酶處理平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶3`-OH的單鏈延伸。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程99用化學(xué)合成的銜接物連接DNA分子銜接物(1inker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10-12個(gè)核苷酸組成的，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程100二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化（transformation）作用就是一種基因型細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一種基因型細(xì)胞的DNA，進(jìn)而使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化能力，但只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定的生理狀態(tài)，一般稱(chēng)之為感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，菌體細(xì)胞才具備攝取外源DNA的能力。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)細(xì)菌。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程101原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法革蘭氏陽(yáng)性菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類(lèi)細(xì)胞通常采用原生質(zhì)（細(xì)胞去壁以后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的原理是：先除去細(xì)胞壁，待外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后放在有利于再生細(xì)胞壁的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程102化學(xué)轉(zhuǎn)化法Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌等），1970年建立此項(xiàng)技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)脈沖收縮作用，使細(xì)胞膜出與空隙（此時(shí)細(xì)菌稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)菌），有利于外源DNA或重組DNA分子的進(jìn)入。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程103電穿孔轉(zhuǎn)化法其基本原理是利用高壓脈沖電場(chǎng)，在宿主細(xì)胞表面形成暫時(shí)性的微孔，質(zhì)粒DNA可乘隙而入，在脈沖過(guò)后，微孔復(fù)原，在豐富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，細(xì)胞增殖，質(zhì)粒復(fù)制。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程104通過(guò)接合作用傳遞質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒由F+向F-菌的轉(zhuǎn)移過(guò)程叫接合作用傳遞質(zhì)粒，又稱(chēng)質(zhì)粒的接合傳遞通過(guò)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞遺傳物質(zhì)

轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞稱(chēng)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程105三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定直接篩選法抗藥性標(biāo)記選擇插入失活法標(biāo)志補(bǔ)救法分子雜交法原位雜交、Southern印跡非直接篩選法免疫學(xué)方法酶免檢測(cè)法

第六節(jié)重組DNA分子的操作過(guò)程106大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因，常見(jiàn)的有抗氨芐青霉素基因、抗四環(huán)素基因、抗卡那霉素基因等。如果外源D