第4章人工種子

與植物脫毒1.人工種子2.植物脫毒1人工種子農業生產中使用的天然種子，一般都是由種皮、胚乳和胚三部分構成。種皮通常在種子的外層起保護作用；胚乳含有大量的營養物質，是種苗萌發生長不可缺少的營養來源；胚由胚芽、胚軸、胚根和子葉構成，將來發成植株。

農業生物技術的發展，通過組織培養技術，可把植物組織的細胞培養成在形態及生理上與天然種子胚相似的胚狀體，也叫作體細胞胚。這種體細胞胚有于葉、根、莖分生組織的結構。科學家把體細胞胚包埋在膠囊內形成球狀結構，使其具備種子機能。所以，人工種子是一種人工制造的代替天然種子的顆粒體，可以直接播種于田間。※人工種子的概念

人工種子（artificialseeds)又稱合成種子（syntheticseeds)或體細胞種子（somaticseeds)。是將植物離體培養產生的體細胚包埋在含有營養成分和保護功能的物質中，在適宜的條件下發芽出苗。人工種子的概念首先是1978年由Murashige在第四屆國際植物組織細胞培養大會上提出的。他認為隨著組織培養技術的不斷發展，可以用少量的外植體同步培養出眾多的胚狀體，這些胚狀體被包埋在某種膠囊內使其具有種子的功能，可以直接用于田間播種。

以體細胞胚為繁殖體的人工種子以器官為繁殖體的人工種子1.1人工種子的制作

人工種子制備包括胚狀體的誘導與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內容。

1.1.1胚狀體的誘導與同步化發育不論是哪一種方式產生的胚狀體，在發生和發育過程中一般是不同步的。所以在一個材料中同時可以見到各個不同發育時期的胚狀體。因此，控制胚狀體同步發育是人工種子制備的關鍵環節之一。1.1.2人工種皮制備分內種皮和外種皮對人工種皮的要求：具有保護胚的功能，并且無毒性、通氣好、抗污染、抗壓性好、不粘連、適于貯藏和運輸。內種皮常用材料：聚氧乙烯、海藻酸鈉、明膠、瓊脂等。外種皮常用材料：

Elvax4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸共聚物，1987，美國)涂膜，價高，操作復雜，效果不佳。Tullanox和Cab-0-sil(二氧化硅化合物），以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層，操作時只需將膠囊在材料中滾動即可。硅酮種衣，能抗真菌，滲入水蒸汽和氧氣，處于試驗之中。1.1.3人工胚乳配制成分：無機鹽混合物、碳水化合物（糖和淀粉）、蛋白質、植物生長調節劑。糖分存在容易導致微生物感染而腐爛，所以人工胚乳中也要加入防腐劑、抗菌素、有益菌類等。選用無毒、透氣和吸水性強的木薯淀粉與1.5%海藻酸鈉(1/2MS培養基配制)混合制作的胚乳可改善單一海藻酸鈉人工胚乳的透氣性、吸水性和發芽率，人工胚乳中加入（赤霉素）GA3有利于人工種子的發芽，加入CaCl2有利于向培養物供氧，提高人工種子發芽率和耐貯藏性，加擴活性炭可改善營養固定和緩釋，提高人工種子在土壤中的成苗率。

1.2貯藏1.2.1貯藏條件：4~7℃低溫、相對濕度小于67%1.2.2貯藏中存在的問題：種胚質量不高、后期停止生長、胚腐爛、種子失水干縮等。1.2.3解決措施：胚乳中添加防腐劑、抗生素、控制糖含量、低溫貯藏，種皮外包裹滑石粉、液體石蠟等成分。存在問題許多重要的植物目前還不能靠組織培養快速產生大量的、出苗整齊一致的、高質量的體細胞胚或不定芽。包埋劑的選擇及制作工藝方面尚需改進，以提高體胚到正常植株的轉化率，并達到加工運輸方便、防干防腐耐貯藏的目的。如何進行大量制種和大田播種，實現機械化操作等方面配套技術尚需進一步研究。小結人工種子是在實驗室人工控制條件下生產的繁殖體。人工種子繁殖體包括體細胞胚、微型器官和微芽，根據植物種類不同可適當選擇。人工種子應用的基本條件是繁殖體的工廠化生產和配套技術的成熟。無性繁殖植物的人工種子有望最先得以應用。

2.1脫毒方法

物理法：熱處理脫毒化學法：藥劑處理生物法：莖尖培養脫毒

1）熱處理脫毒原理：

①病毒是DNA大分子，病毒進入植物細胞后，隨植物細胞DNA一起復制。熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。②熱處理是一種物理效應，可加速植物細胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋白合成占優勢，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。

2.1.1物理方法——熱處理脫毒

依據病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利用這一差異，選擇適當的溫度和處理時間，進行高溫處理，就能使寄主體內病毒濃度降低，傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細胞仍然存活，并加快分裂和生長。熱處理區低溫高溫生長區寄主無損傷病原微生物被消除寄主被殺死BAC

熱處理廣泛應用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊花等植物。如：葡萄置于38℃可去除扇葉病毒。熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒不起作用，因此，必須與莖尖培養相結合脫毒效果更好。2.1.2化學方法脫毒

又稱化學療法。一些化學藥品如嘌呤和嘧啶；類似物、氨基酸、抗生素處理，可在某種程度上抑制植物體內或離體葉片內病毒的合成，但仍不能是病毒失活。近年發現三氮唑核苷（1—β—D—呋喃核糖—1，2，4—三氮唑）用于防治一系列動物DNA和RNA病毒，對植物也有效。將感染了馬鈴薯Y型病毒（PVY）、黃瓜花葉病（CMV)或煙草花葉病毒（TMV）的葉柄，培養在三氮唑核苷的MS培養基上，子代植株則除去病毒，而對照則無效，說明三氮唑核苷抑制病毒的增殖。

2.1.3生物法莖尖脫毒莖尖微體嫁接愈傷組織誘導脫毒珠心胚培養法花藥培養脫毒（1）莖尖培養脫毒原理

病毒在植物體內分布不均勻，其數量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區域，病毒感染的程度越低，生長點即分生組織（約0.1-1mm）幾乎不含或含病毒很少。

植物的去病毒技術，實質上就是采取不含病毒顆粒或病毒顆粒含量甚少的0.1～0.5mm帶1～2個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁殖，使其培養成完整的無病毒小植株的技術。（3）莖尖的培養方法

需要一臺解剖鏡（8-40倍）。剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有無菌濕濾紙的培養皿內進行操作，以防莖尖變干。

消毒：葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成活，過大又不能保證完全出去病毒，所以莖尖大小要合適。TheApicalMeristem

剝取莖尖過程:

解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒。當一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將帶1-2個葉原基的分生組織切下，接到培養基上。

將接種的莖尖置于22℃左右溫度下。2000-3000lx16h/d光照下培養。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數月才能成功。

莖尖培養的繼代培養和生根培養和一般器官的培養相同。

莖尖培養脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個途徑。

（4）影響微莖尖成活及脫毒的因素首先是母體材料病毒侵染程度被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復合感染的較難。

①外植體大小

在最適培養條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產生再生植株的機會也就越多。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認為，葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細胞分裂素。②培養條件

在莖尖培養中，光下培養的效果通常比暗培養效果好，如馬鈴薯莖尖培養時，當莖已長到1cm高時，光照強度便增加到4000lx。

③外植體的生理狀態

莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。

取芽的時間也很重要，一般選萌動期較好。否則采用適當的處理，打破休眠才能進行。

莖尖與熱處理相結合方法

能克服單獨莖尖培養時，莖尖過小成活率太低，莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點。1、熱處理后取較大莖尖培養獲得脫毒苗。2、取莖尖（或莖段）培養獲得無菌苗。然后將試管苗熱處理，再取莖尖培養獲得脫毒苗。

2）莖尖微體嫁接

木本植物莖尖培養難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4-1mm莖尖，在砧木上進行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。3）愈傷組織培養脫毒

愈傷組織細胞帶病原菌不均一，部分細胞不帶病毒，由這些細胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。

愈傷組織的某些細胞不帶病毒原因：

1、病毒的復制速度趕不上細胞的增殖速度；2、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩定，可能會產生變異植株。4）珠心培養法脫毒

柑橘類多胚品種中除了一個受精胚以外，尚有多個由珠心細胞形成的無性胚，稱為珠心胚。珠心胚與維管束系統無聯系，因此由珠心胚產生的植株全部均無病毒。但珠心胚大多是不育的，必須分離培養才能發育成正常的幼苗。珠心胚培養技術對除去柑橘主要病毒，如引起銀屑病、葉脈突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。5）花藥培養脫毒

花藥培養實際上是單倍體培養，由此獲得單倍體植株，再通過染色體加倍獲得無病毒植株。2.2脫毒植物的鑒定

利用生長點培養無毒苗的成苗率和脫毒率都非常低，有時無毒株只占千分之幾。因此，每一莖尖分化產生的植株，在作為母本生產無病毒原種以前，必須進行特定病毒鑒定。由于在培養的植株中許多病毒具有延遲的恢復期，所以在最初18個月中每隔一定時間仍需進行鑒定。只有病毒顯示持續陰性反應的無病毒植株，才能進一步擴大繁殖。無病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同時期仍需重復進行鑒定。常用的鑒定法有直接測定法、指示植物法、抗血清鑒定法和電子顯微鏡檢查法等。

外觀判斷法——直接檢測法指示植物法抗血清鑒定法電子顯微鏡檢查法酶聯免疫鑒定法(ELISA)

分子生物學方法2.2.1外觀判斷法：

帶病毒株往往葉片發黃，凹凸不平，畸形，可根據這些表現來判斷。但有些病毒表現不明顯，僅靠這一方法還不夠。2.2.2指示植物檢測法：

指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特定病毒非常敏感，而且癥狀表現十分明顯的植物。通常不同病毒應選用不同的植物。馬鈴薯病毒常用指示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。