基因工程和基因組學第1頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1971年，Smith等人從細菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標志著DNA重組時代的開始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來

得到新的DNA分子。第2頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1973年，美國斯坦福大學醫學院的Cohen教授及其同事把抗四環素基因插入大腸桿菌質粒DNA后，組成一個重組DNA，結果發現這一個重組DNA能在大腸桿菌中復制,并具有抗四環素遺傳表型。StanleyN.Cohen第3頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1974年,Cohen教授和加州大學的Boyer教授，將非洲蟾蜍的rRNA結構基因插入大腸桿菌質粒DNA，再轉化入大腸桿菌，結果發現非洲蟾蜍的rRNA結構基因得到表達。上述實驗說明，經DNA重組后的外源基因可在宿主體內成功表達。HerbertW.Boyer第4頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1982年，美國食品衛生和醫藥管理局批準，用基因工程在細菌中生產人的胰島素投放市場。1985年，轉基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉基因番茄商品生產。1996年，克隆羊誕生。第5頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四以轉基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉基因作物種植面積由1996年的2550萬畝發展到2009年的20億畝，14年間增長了79倍。19961997199819992000200120022006200720082009第6頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質工程、細胞工程、染色體工程、細胞器工程、基因工程及酶工程等。狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術)。

一、基因工程概述:第一節基因工程第7頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設方式,按照預先設計的藍圖，借助于實驗室技術將某種生物的基因或基因組轉移到另一種生物中去，使后者定向獲得新遺傳性狀的一門技術。基因工程技術的建立，使所有實驗生物學領域產生巨大的變革。基因工程是采用分子生物學、核酸生物化學以及微生物遺傳學的現代方法和手段建立起來的綜合技術。

第8頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四切接轉增檢2．基因工程操作過程：第9頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四3．內容：①從細胞和組織中分離DNA；②限制性內切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③

將酶切DNA分子與載體DNA連接構建能在宿主細胞內自我復制的重組DNA分子；④

把重組DNA分子引入宿主受體細胞復制；⑤

重組DNA隨宿主細胞的分裂而分配到子細胞建立無性繁殖系(Clone)或發育成個體；⑥

從宿主細胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子；⑦

使外源基因在受體細胞中正常表達，翻譯成蛋白質并分離、鑒定基因產物。目的基因載體轉化與鑒定內切酶重組DNA表達第10頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四一般而言，一個基因是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段，包括啟動子、終止子及內含子等。在DNA重組技術出現之前，由于DNA分子量大而結構單一，DNA是細胞中最難分析的大分子。DNA重組技術發展成功之后，DNA已成為細胞中最易操作分析的大分子。二、基因的分離與鑒定利用這一技術，可從一個含有10萬個基因的大基因組中，準確地分離出特異的單個目的基因。第11頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四㈠從基因庫中分離基因：1.構建基因庫（library）基因庫是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。根據克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等。第12頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四①核基因庫：核基因庫(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構建而成的。理想的核基因庫應能包括全部基因組序列。第13頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四構建文庫可采用不同的載體：

質粒載體：重組質粒導入感受態細胞，收集所有菌落。噬菌體或(柯斯質粒)載體：重組DNA包裝進噬菌體，感染細菌，收集噬菌斑。BAC(細菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體，導入相應宿主細胞，收集所有細胞，即為基因庫。第14頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四②染色體基因庫：將基因組的一部分如一條染色體用來構建基因庫可選擇特異基因以及分析染色體結構和組織。第17頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四果蠅的多線染色體中，對染色體進行微切割，構建染色體區段基因文庫。如對X染色體上多線染色體帶的分析。第18頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四人類基因組項目研究中，利用流動細胞分離(flowcytometry)技術將人類染色體分開，用于構建單個染色體基因庫，大大加速了人類基因組作圖和分析。流式細胞分離原理第19頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldgelelectro–phoresis,PFGE)，將酵母菌16根染色體據其分子量大小分開后，用于構建染色體庫，在基因組分析中發揮作用。第20頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四③cDNA庫：以mRNA為模板經反轉錄酶合成互補DNA構建基因庫。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T為引物與多聚A互補配對，在反轉錄酶的作用下，即可獲得cDNA第一鏈。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列得到的雙鏈DNA分子經兩端補齊后以帶有限制性酶切點的人工接頭連接酶切后與載體(通常是噬菌體)連接制備cDNA庫。第21頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四mRNA1.cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一鏈引物退火逆轉錄酶dNTPs第22頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2.cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’第23頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’第24頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四dCTPTdT引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPs第25頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

cDNA庫與核DNA庫不同：cDNA庫僅具有細胞或組織內表達基因的mRNA序列僅包括基因組的部分基因序列。

cDNA庫對于研究基因的表達模式、分離某一特定基因是十分有用的。

通常是將cDNA庫與核基因庫配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調控序列。第26頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2.篩選基因庫：根據待選基因相關信息

確定篩選方法和條件從基因庫中篩選、分離基因；常用的基因庫篩選方法有表型篩選法、雜交篩選法、混合池PCR篩選法、差減雜交法、圖位克隆法、酵母雙雜交法等；多數方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針篩選基因庫。第27頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆文庫篩選流程第28頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四篩庫過程：將轉化或轉染后菌落印影在濾膜上用堿裂解、中和后洗滌烘干再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探針進行雜交放射性自顯影凡黑點菌落即為陽性克隆。影印洗滌雜交感光第29頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四①.限制性酶圖譜：構建陽性克隆的限制性酶圖譜

根據同源性分析，可了解陽性克隆片段的酶切位點及相對位置

用于進一步亞克隆或同已知的其它序列比較。(二)陽性克隆的分析與鑒定：從基因庫中篩選出的陽性克隆

分析、鑒定

得到目的基因。第30頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四限制性酶圖譜構建方法(15kb)將陽性克隆DNA分裝3個管中酶切DNA瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色紫外燈下見到DNA帶。

從凝膠電泳結果分析：模式Ⅱ就是這個15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜。第31頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四用類似的方法，將不同DNA用限制性酶消化，根據其產生的多型性，即限制性酶片段長度的多型性來分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標記進行基因組圖譜分析。第32頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四②.核酸分子雜交：Southern雜交分析：由英國的Southern發明(1975)，一種將瓊脂糖中的DNA轉移到尼龍膜進行DNA分子雜交分析的方法。篩選基因庫得到陽性克隆后將限制性酶酶切與Southern雜交結合繪制限制性酶圖譜。第33頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四Northern雜交分析：用于分析克隆的基因在某一細胞或組織的轉錄水平，檢測mRNA的存在。原理和程序與Sorthern雜交相同。Western雜交分析：用于蛋白質的分析。第34頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四③.核酸序列測定克隆后的DNA片段進行核酸序列測定后確定該DNA片段序列的正確性。一般采用Sanger(1977)發明的雙脫氧核糖核酸終止法測定核酸序列。CGCTCAGCTGGTGATTGTGT第35頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四55333-5磷酸二酯鍵第36頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四在Sanger雙脫氧法中，可用熒光標記來代替放射性標記：第37頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四④.核酸序列分析：測定的核酸序列為何基因、有什么功能，需用計算機軟件或生物學實驗進一步分析。第38頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（1）同源性比較將待測序列在核酸和蛋白質兩個水平上比較基因間的同源性，將序列發送到Genbank等DNAData數據庫進行比較。EMBL,為設在歐洲分子生物學實驗室的基因庫,網址：http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;Genbank,為設在美國國家衛生研究院(NIH)的基因庫,網址：;Swissport/TREMBL網址：/sprot第39頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第40頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第41頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第42頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第43頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第44頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

對于那些同已知序列無任何同源性的新序列，可能還要進行基因功能性研究。一個ORF是一條能編碼一條多肽鏈的DNA序列，具有翻譯起始信號和終止信號等。（2）分析核酸序列的閱讀框架第45頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

GmMYBZ2ORF：744bp247aaMYB-DNAbinding1:13-63aaMYB-DNAbinding2:65-114aa具有轉錄抑制作用的保守基序：pdLNLD/ELXiG/S

第46頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

GmMYBZ2空間結構預測（CHPmodels-2.0服務器）GmMYBZ2蛋白的三維空間結構預測紅色：a-螺旋；藍色：b-折疊；白色：無規卷曲

第47頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（三）PCR擴增基因：聚合酶鏈式反應(polymerasechainReaction,PCR)可以體外快速擴增DNA。美國Mullis(1986)發明，是現代生物學發展史上的一個里程碑。PCR技術是以DNA互補鏈的聚合反應為基礎，通過DNA變性、引物與模板DNA一側的互補序列復性雜交，由DNA聚合酶催化引物延伸，最終獲得特異DNA片段的體外擴增方法。第48頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四DNA模板變性退火延伸循環1變性退火延伸循環2RF1324第49頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四變性退火延伸循環31234第50頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基本要素模板：待拷貝的DNA,可以是雙鏈,也可是單鏈DNA；引物：引導DNA的合成。在PCR擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物；DNA聚合酶：DNA復制的動力，在dNTP等底物存在時在引物的引導下沿著模板DNA合成互補的DNA鏈。dNTP：DNA合成的底物。使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據該序列化學合成聚合反應必需的雙引物。第51頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（四）人工合成基因：根據已知的基因或氨基酸序列，將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結合起來可很快地人工合成基因。如SOE-PCR(splicingbyusingoverlappedextension)技術可擴增出完整的基因序列。第52頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四化學合成的寡聚核苷酸(80-100個核苷酸)通過SOE將單鏈部分補齊；2.PCR擴增DNA片段；3.DNA變性；4.兩個單鏈部分經SOE補齊

雙鏈；5.PCR擴增DNA，利用多級SOE-PCR擴增出完整的基因。第53頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1.限制性內切酶(restrictionenzyme)：一類能識別雙鏈DNA分子中一段特定的核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。

三、限制性內切核酸酶第54頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2.限制性內切酶的命名：用屬名的第一個字母和種名的前兩個字母，組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名稱;如：大腸桿菌(Escherichiacoli)

用Eco表示；流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)

用Hin表示。用一個寫在右下方的字母代表菌株或類型；如EcoK，Hind。用羅馬數字表示不同的限制和修飾體系，如：HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等。第55頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四3.限制性內切酶的類別：第Ⅰ類酶:每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性,酶切位點不定。

第Ⅱ類酶:能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅲ類酶:能識別位點分別是AGACC和CAGCAG,切割位點則在下游24-26bp處。第56頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四4.第Ⅱ類核酸內切酶特性：在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子產生鏈的斷裂；靶序列：具有雙重旋轉對稱結構的回文序列；ABCC′B′A′ABCC′B′A′ABNB′ABN′B′A′A′回文序列(palindrome)：從兩個方向閱讀而序列相同的序列。第57頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四對靶序列的切割：(1)

產生平末端(bluntend)的切割如SmaⅠ：兩條鏈上的斷裂位置處于一個對稱結構的中心。第58頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四(2)產生粘性末端(stickyend)的切割兩條鏈上的斷裂位置是交錯的、但又是對稱地圍繞一個對稱軸排列。如EcoRⅠ：粘性末端:

DNA分子在限制性內切酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構。第59頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第60頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四同裂酶:來源不同但可識別相同核苷酸靶序列，產生同樣的切割并形成同樣末端的限制酶。如HpaⅡ和MspⅠ均可識別CCGG。同尾酶:來源不同，識別的靶序列也各不相同，但都能產生同樣粘性末端的限制酶。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCA第61頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四載體：將“目的”基因導入受體細胞的運載工具。

DNA片段與適合的載體DNA連接構成重組DNA在載體DNA的運載下，高效率地進入宿主細胞，并在其中進行復制。DNA載體：質粒、噬菌體DNA、病毒DNA、細菌或酵母菌人工染色體等。四、載體（vector）：第62頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四載體的條件：①具有復制原點，能自我復制；②具有多克隆位點(multiplecloningsite，MCS)即有多種限制酶的切點；③具有選擇標記基因，如抗生素基因；④易從宿主細胞中回收。第63頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（一）細菌質粒：質粒是細菌細胞內獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復制、易分離和導入的環狀雙鏈DNA分子。質粒具有重組表型檢測標記，檢測是否攜帶外源DNA片段。在細胞內的復制程度：嚴緊型：一個細菌細胞內的質粒數量有1-2個；

松馳型：每個細胞內有的20-60個。第64頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四pUC18質粒具有以下特點：③多克隆位點中的酶切位點多，克隆方便；④具有a－互補的顯色表型，用于檢測重組質粒的選擇標記。①分子量小，可接受較大外源片段(10Kb)；②拷貝數多，每個細胞中有500個；第65頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四a-互補：指來自細菌DNA的b-半乳糖苷酶(lacZ)N端的一段氨基酸殘基(a-肽)，在與a-肽缺失的b-半乳糖苷酶混合后，能夠回復lacZ酶活性的一種基因內互補現象。第66頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基因組全長49kb。噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。中間基因簇可被外源DNA替代而不影響浸染細菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作為cDNA或核DNA克隆的載體。（二）λ噬菌體(溫和型)：第67頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

優點：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基因進入細胞并增殖；1.攜帶大片段外源DNA分子，可占用總量的25%時仍不失活。第68頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（三）柯斯質粒(cosmid)：部分λ噬菌體DNA+部分細菌質粒DNA序列組建柯斯質粒。帶有噬菌體cos序列和細菌質粒復制原點、抗生素抗性標記。第69頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四這種質粒分子量較小，但可接受長達50kb的外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用。∵一個長片段DNA可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調控序列。第70頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（四）細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC載體可以攜帶大于50kb的外源DNA片段。

特點：帶有外源DNA的BAC載體在細胞中是單拷貝的；載體本身分子量很小(7.4kb)；選擇標記：氯霉素抗性基因；

多克隆位點位于lacZ基因內。F因子經基因工程改造成BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。第71頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（五）酵母人工染色體(YAC)：YAC具有自主復制序列、克隆位點和可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因；還具有酵母菌染色體一些特點；可接受100-1000kb的外源DNA片段。YAC已成為人類基因組計劃和圖位克隆基因的重要工具；并促進了人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。1996年完成了酵母菌全基因組序列的測定第72頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四指能在兩種不同的生物中復制的載體。如能在原核生物（如E.coli）、真核細胞（如酵母）中復制的載體。穿梭載體需同時具有細菌質粒的復制原點、真核生物自主復制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及兩者的選擇標記。（六）穿梭載體(shuttlevectors):第73頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四穿梭載體在細菌中用于克隆、擴增基因，在酵母菌中用于基因表達分析。

酵母菌的YEp(yeastepisomaplasmid)和YRp系列載體均是穿梭載體。穿梭質粒YEp24第74頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

pCAMBIA2301載體第75頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第76頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（七）Ti質粒及其衍生載體：適合于植物的載體系統將重組DNA運載到植物細胞并使目的基因表達。Ti質粒是一種細菌質粒，它自然存在于土壤農桿菌(革蘭氏陰性菌)(Agrobacteriumtumefaciens)細胞中可誘導植物產生瘤細胞(tumor-Inducing

Ti)

冠癭瘤(growngalltumors)。第77頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四Ti質粒一部分DNA叫轉移DNA(transferDNA，T-DNA)，當農桿菌感染植物時，T-DNA便轉移到植物的染色體上，誘導冠癭瘤，并能合成冠癭堿(opine),作為農桿菌的碳源和氮源。農桿菌感染產生冠纓瘤第78頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第79頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第80頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第81頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四目前，基因工程研究發展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技術已廣泛用于工業、農業、畜牧業、醫學、法學等領域，為人類創造了巨大的財富。五、基因工程的應用具有生長激素的轉基因鼠第82頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四㈠基因工程工業

最早應用基因工程生產人的蛋白質的方法是在細菌中表達人的胰島素(1982)。

胰島素是一種控制糖代謝的蛋白質激素。不能產生胰島素的患者會有糖尿病，患者必須每天注射胰島素。

現已在細菌中生產10多種醫藥產品，如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。第83頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四胰島素的人工生產第84頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

有些真核細胞的蛋白質需要糖基化等修飾加工以后才具有活性，而細菌細胞缺少真核細胞的這些修飾系統真核生物細胞更適合于表達真核生物蛋白質基因。

目前，酵母菌、植物懸浮細胞、植株和動物培養細胞成功地均應用于表達外源蛋白。基因工程應用大腸桿菌生產人類生長激素第85頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四（二）植物基因工程

植物基因轉化是指將外源基因轉移到植物細胞被內、并整合到植物基因組中穩定遺傳和表達的過程。基因轉化的方法和技術第86頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

農桿菌轉化法和基因槍轉化法應用最多。第87頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1.根癌農桿菌轉化技術：根癌農桿菌介導的植物轉化是應用的最早最廣泛的植物轉化方法（雙子葉植物、單子葉植物）。過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子；插入到Ti衍生質粒RB與LB內構成重組質粒；再轉化到農桿菌細胞；將重組農桿菌去感染植物細胞（組織）；使Ti質粒的部分DNA（攜帶目的基因），整合到植物染色體，實現遺傳轉化。第88頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合成酶）基因，已培育出高抗除草劑轉基因植物。第89頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基因槍法植物轉化是通過高壓氣體為動力，高速發射包裹有重組DNA的金屬顆粒將目的基因直接導入植物細胞，并整合到染色體上的方法。2.基因槍轉化技術：轉化的載體多數是以pUC系列質粒為基礎構建的。它們通常具有細菌復制原點及抗性選擇標記，具有可在植物中表達的啟動子終止子及調控序列，以及植物抗性選擇標記(如除草劑、潮霉素等抗性)。第90頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四

幾種基因槍類型的共同特點：是用一種動力系統將包被DNA的金屬微粒導入受體細胞或組織進行轉化。1.位于高壓氣體桶底部的爆破片；2.載有重組DNA和金屬微粒的微彈載體；3.阻攔網；

4.

包裹有重組DNA的金屬微粒；5.被轟擊樣品。第91頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四㈢轉基因動物:與轉基因植物相比，轉基因動物的發展要慢些。這主要涉及到一些技術難題，以及倫理學、宗教等問題。轉基因動物：將外源重組基因轉染并整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體表達外源基因的動物，稱為轉基因動物。第92頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四轉基因動物是如何獲得的呢？第93頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四受體細胞的準備受精卵：注射促性腺激素，使動物超數排卵，從而收集、獲得合適的受精卵；胚胎干細胞：從早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離獲得具有正常二倍體染色體和發育全能性的細胞。基因的準備線形DNA或環形DNA均可，但線形DNA整合率要高于環形DNA；環形DNA在細胞內的半衰期較長，使用于瞬時表達和基因治療。第94頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基因的轉化利用顯微注射法、電擊法、脂質體介導等方法將目的基因轉入受體細胞中；通過篩選基因篩選陽性轉化子；陽性轉化子的培養將陽性轉化子轉入合適的培養基中，培養至囊胚期；第95頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第96頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四胚胎移植胚胎移植：將供體的受精卵或早期胚胎，移植到同種的生理狀態相同的其他受體體內，使之繼續發育成為新個體的技術，也稱作借腹懷胎。轉基因個體的鑒定對代孕母獸產下的幼獸進行相關分子鑒定，首先，檢測目的基因是否整合到了受體的基因組中；其次，檢測目的基因是否表達；最后進行表達產物的分離純化及生物活性檢測。第97頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第98頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四卵細胞的獲得費時費力；很多人認為，從胚胎中收集胚胎干細胞是不道德的，因為動物的生命沒有得到珍重，動物的胚胎也是生命的一種形式，無論目的如何高尚，破壞胚胎是不可想象的；動物的體細胞是否可以作為轉基因的受體細胞呢？第99頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四生物學家一度認為，由一個成熟的動物細胞“無性繁殖”成一個子體是不可能的。1997年，克隆羊“多莉”的誕生，徹底打破了這種不可能性，并立即引起世界的震驚和媒體的關注。第100頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四克隆羊“多莉”的誕生300個277個29個1只第101頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四乳汁中含有α抗胰蛋白酶轉基因羊各種克隆動物相繼誕生第102頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1997年，夏威夷科學家從成年小老鼠的細胞復制出第一只克隆小老鼠，名叫Cumulina。Cumulina兩歲零七個月死亡,這是一個比較正常的死亡年齡，比普通老鼠的平均壽命長7個月。它曾經生產了兩次。第103頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四1998年日本科學家用子宮和輸卵管細胞成功克隆牛,首兩頭克隆牛分別名為“KAGA一號”和“NOTO一號”之后，日本復制出了數千克隆牛。出生于一九九八年八月的克隆牛“KAGA二號”產下了小牛。第104頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四世界上第一批三只克隆山羊已由美國一家生物公司于1998年“制造”出來。克隆山羊Mira和她的姐妹們都來自美國的實驗室，它們生產含有人類抗凝血酶-3的羊奶。抗凝血酶-3是血液天然含有的蛋白質，其功能是協助控制血凝。第105頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2000年，科學家從兩頭分別死亡將近18小時和24小時的雌盤羊卵巢內取出DNA，將其注入盤羊的“近親”――普通白羊的卵細胞內，克隆出了一只摩弗倫羊（又稱歐洲盤羊）。這是世界上首次把克隆技術應用于一種瀕臨滅絕的哺乳類動物身上。第106頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2003年5月29日，一頭名叫“愛達荷寶石”的克隆騾子在美國愛達荷大學（UniversityofIdaho）與公眾見面第107頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2005年韓國科學家培育出世界首只克隆狗“斯納皮(Snuppy)”第108頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2005年10月意大利著名的克雷莫納繁殖技術研究中心成功地克隆出了14只小豬仔第109頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2006年11月美國維亞金公司宣布成功克隆出純種賽馬“克萊頓”第110頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四我國體細胞克隆牛"康康"，在萊陽農學院動物胚胎工程中心第111頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四西北農林科技大學克隆山羊第112頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四山東曹縣五里墩中大動物胚胎工程中心第113頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四人類生長激素轉基因豬同胞鼠對照轉移有人類生長激素轉基因鼠第114頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四轉基因熒光豬第115頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四㈣遺傳疾病診斷：利用重組DNA技術進行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進行診斷準確度高，速度快。進行產前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。第116頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四b-球蛋白基因MstⅡ酶切結果第117頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四㈤基因治療：利用基因工程技術，將特異基因導入并整合到有遺傳缺陷患者的基因組中治療遺傳疾病，通常叫做基因治療(genetherapy)。方法：利用減毒的病毒DNA作載體(retrovirusDNA)構建重組DNA分子用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細胞將正常基因整合到染色體上。第118頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus載體，已用于治療嚴重綜合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脫氫酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起的，患者無任何免疫功能。第119頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2000年法國Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的兩個嬰兒（8個月和11個月）。這一工作被認為是20世紀人類基因治療上的重大突破。方法：將ADA基因導入到MLVretrovirus

載體中取代該病毒DNA中的三個結構基因(gag、pol、env)將重組后的病毒去感染T細胞，使ADA基因整合到T細胞的染色體中實現基因治療的目的。第120頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四核酸分子雜交的原理和方法+半導體技術結合發展形成的一門新技術。這一技術可使許多分子雜交反應同時進行。

DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龍等。㈥DNA芯片(DNAchips)第121頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四在面積不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地點陣排列于一定位置的、可尋址的核苷酸分子；將待分析核苷酸分子標記(如用熒光)，變性成單鏈與芯片上序列相同的核苷酸分子雜交；與芯片上序列不同的核酸分子被洗掉；利用高精度的激光掃描儀記錄分子已雜交的熒光信號；計算機軟件分析。第122頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基因多態性檢測（如單核苷酸多態性篩選

singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表達分析(不同細胞和不同組織的RNA群體比較)；

克隆選擇及文庫篩選（如cDNA文庫）；基因突變檢測及遺傳病和腫瘤的診斷等。DNA芯片技術應用領域：第123頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四用基因芯片預測“未病之病”

通過基因芯片靈敏快速的檢測癌基因及正常基因的表達變化,從而實現中國古語中“上醫治未病”的理想,對疾病作出前瞻性的診斷,這就是“基因診斷”

第124頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四第二節基因組學基因組學(genomics)：研究生物基因組和如何利用基因的一門學問。該學科提供基因組信息以及相關數據系統利用，試圖解決生物、醫學、和工業領域的重大問題。第125頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四研究對象：以整個基因組為研究單位，而不以單個基因為單位作為研究對象。研究目標：認識基因組的結構、功能和進化；

闡明整個基因組所包含的遺傳信息和相互關系；

充分利用有效資源，預防和治療人類疾病。第126頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四重要組成部分：基因組計劃(genomeproject)大體上可分為：⒈構建基因組的遺傳圖譜；⒉構建基因組的物理圖譜；⒊測定基因組DNA的全部序列；⒋繪制基因組的轉錄本圖譜；⒌分析基因組的功能。第127頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基因組計劃研究開始于1990年。

美國啟動被譽為“人體阿波羅計劃”的“人類基因組計劃”，投資30億美元，歷時15年測定人類基因組的30億個核苷酸對的排列次序構建高分辨率的人類基因組遺傳圖譜和物理圖譜發展生物信息學。人類基因組計劃第128頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四在美國提出人類基因組計劃后，日本和中國分別于1991年和1992年啟動了“水稻基因組計劃”。第129頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四由于以人類為對象的研究實際上受到諸多限制，也受倫理學的約束，所以人類基因組計劃還將對有關的模式生物，如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥等進行相應的研究，為研究人類基因組的戰略提供重要的依據。第130頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2002年4月5日《Science》以14頁的篇幅刊登和宣布中國科學家獨立繪制完成水稻基因組草圖序列(總數：4.6億)，是繼人類基因組工作草圖(2001年春)之后完成測定的最大基因組。(2001年12月14日美、英等國科學家宣布繪制出擬南芥基因組的完整圖譜)秈稻基因組草圖第131頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四材料：秈稻。完成單位：華大基因研究中心，中科院遺傳與發育生物學研究所等12個單位，2001年7月啟動。水平：水稻基因組中的總基因數約為46022~55615個（接近人類基因數的兩倍），工作框架圖序列已覆蓋水稻整個基因組92％以上的基因。方法：“鳥槍射擊法”，利用國產曙光2000、曙光3000超級計算機(1000億次/秒)對隨機DNA碎片進行排序和組裝，確定其在基因組的正確位置。計劃：功能基因分析和蛋白質研究。第132頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2002年11月21日《Nature》宣布中國科學家獨立繪制完成粳稻基因組第四號染色體精確測序圖，使我國對國際水稻基因組測序計劃貢獻率達到10%。

粳稻基因組草圖第133頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四材料：粳稻“日本晴”。完成單位：中科院國家基因研究中心等4家單位。整個國際水稻基因組計劃始于1998年，日本、美國、中國、法國等國家和地區參加。水平：第四號染色體中的總堿基數目為0.35億堿基對，覆蓋了該染色體全長序列98％的區域，只剩下7個小空洞，測序堿基序列的精確度達到99.99%。完整測定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。計劃：對預測鑒定的4658個基因作進一步分析、著絲粒功能等研究。第134頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2007年10月初，我國科學家對外宣布，他們已經成功繪制完成第一個完整中國人基因組圖譜，又稱“炎黃一號”，這也是第一個亞洲人全基因序列圖譜。

首個中國人基因組圖譜繪制第135頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四如果將這個基因組序列寫成一本書，高度將與384米的深圳地王大廈相同。人類基因組序列圖譜揭示了某個人的遺傳密碼，他的祖傳命運、以及未來可能發生的病變。第136頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四在不久的將來，人類將可能人手一份“基因身份”，里面記錄了只屬于你自己的遺傳信息。特別是某些遺傳缺陷會被早發現早治療，祖先的命運因此而不必在你身上重演。目前，在美國為一個人進行所有的基因檢測費用高達2000萬美元，在國內的價格也達到200萬人民幣。到2020年，在現有科學發展水平上為一個人繪制出基因圖，可能只需要1萬；第137頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四一、基因組圖譜的構建小基因組物種常用鳥槍法測序法第138頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四解決方法：大基因組測序存在兩個問題：片段數(n)龐大，片段間連接和裝配非常復雜；基因組中相同或相似的重復序列在連接和裝配時容易出錯。大規模序列測定前，構建基因組圖譜可作為序列測定中制定測序方案的依據，以便錨定測知的核酸序列在染色體上的位置。第139頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四測序方法：克隆連續序列法(clonecontig)：將基因組DNA切割長度為0.1Mb-1Mb的大片段克隆到YAC或BAC載體上分別測定單個克隆的序列再裝配連接成連續的DNA分子。定向鳥槍射擊法(directedshotgun)：以基因組圖譜中標記為依據測序裝配和構建不同DNA片段的序列。第140頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四基因組圖譜根據構建的途徑，可分為兩種：遺傳圖譜：根據遺傳性狀(如已知基因位點、功能未知的DNA標記、可鑒別的表型性狀)的分離比例將其定位在基因組中，構建相應的連鎖圖譜。物理圖譜：描繪DNA上可以識別的標記的位置和相互之間距離(以堿基對的數目為衡量單位)的圖譜。第141頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四㈠遺傳圖譜的構建：1.圖譜標記：凡是位于染色體上易于檢測識別、在不同個體之間存在差異（多態性），而且可以穩定遺傳的位點，都可以作為遺傳作圖的標記。缺點：基因數目有限、所構建的遺傳圖譜不詳細、標記間的遺傳距離較大。⑴.基因標記：基因控制性狀的表現，所以也就是利用可以鑒別的形態、生化等表型性狀作標記，第142頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四⑵.DNA標記：每種生物DNA具有穩定性，∴DNA本身可作為構建遺傳圖譜的標記；主要有以下3種類型：①限制性內切酶多型性②簡單序列長度多型性③單核苷酸多型性第143頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2、遺傳圖譜的構建：⑴遺傳作圖的遺傳學原理：遺傳圖譜的繪制主要依據是經典的孟德爾遺傳學的連鎖和交換規律。通過重組率確定遺傳標記在染色體上的相對位置，從而繪制遺傳圖譜。⑵不同模式生物的連鎖分析：有性雜交實驗的連鎖分析及系譜分析轉化、轉導及結合等第144頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四(二)物理圖譜的構建：1.構建物理圖譜的原因：⑴遺傳圖譜的分辯率有限：⑵遺傳圖譜的精確性不高：第145頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四2.物理圖譜的構建：⑴

限制性酶圖譜：利用限制性內切酶繪制圖譜，對于DNA分子長度<50Kb的片段，一般沒有什么困難。(46=4094bp)而對于>50Kb的DNA分子，可選用稀有切點內切酶酶切DNA。(48=65536bp)第146頁，共158頁，2023年，2月20日，星期四⑵熒光原位雜交:是另一物理圖譜構建方法通過熒光標記的探針與DNA分子雜交，使染色體上的雜交信號（位置就是探針DNA在染色體上的圖譜位點）