定量蛋白組學百替生物第1頁/共30頁

從基因組學到蛋白質組學

人類邁入后基因組時代20世紀上半葉，以遺傳學為代表，以DNA雙螺旋結構的提出而告捷；20世紀下半葉，以分子生物學為代表，以“中心法則”的問世，DNA重組技術誕生而集大成；20世紀90年代，“人類基因組計劃（humangenomeproject，

HGP）”的提出。第2頁/共30頁基因組計劃的局限：

40～60%的基因編碼的蛋白質的功能是未知的。基因組研究的局限性

常規大規模基因表達檢測技術，無法精確反映蛋白質的質與量，組織中mRNA的豐度與蛋白質的豐度并不完全一樣。因為基因到蛋白質存在三個層次的調控；蛋白質復雜的后修飾無法從mRNA水平來判斷。第3頁/共30頁蛋白質組學最早是由MarcWilkins在1995年提出的，源于蛋白（Protein）與基因組學（Genomics）兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組學本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。第4頁/共30頁對一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜混合體系內所有蛋白質進行精確鑒定和定量。可用于篩選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達蛋白，結合生物信息學揭示細胞生理病理功能，同時也可對某些關鍵蛋白進行定性和定量分析定量蛋白質組學(QuantitativeProteomics)第5頁/共30頁定量蛋白質組學技術Spectralcounts

InvitroInvivoPeakareaSILAC/15NICAT/iTRAQ第6頁/共30頁雙向電泳技術

（

Two-dimensionalelectrophoresis）原理：利用蛋白質的等電點（pI)和分子量(Mr)不同而分離蛋白質。第一向電泳：等電聚焦（IsoelectricFocusing，IEF）根據蛋白質的等電點不同將蛋白質分離；第二向電泳：十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）利用蛋白質的分子量大小不同將蛋白質分離。第7頁/共30頁

雙向電泳流程

基于2D的經典定量分析方法。

1、樣品準備和定量：抽提對照組和各種不同實驗組的蛋白質。

2、蛋白質分離：蛋白質經過2D分離后染色（銀染、考染等）。

3、蛋白質的定性與定量分析：通過與對照組相ImageMaster7.0分析出實驗組中差異點，質譜鑒定差異點蛋白質,同時應用軟件分析出其表達量的變化。第8頁/共30頁缺點：

極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質，極大蛋白質、極小蛋白質及低豐度蛋白質用此種技術難于有效分離。膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜聯用實現自動化。敏感性和精確低第9頁/共30頁常見的同位素標記技術化學標記法：

（1）ICAT法（同位素親和標簽技術，isotope-codedaffinitytags）（2）iTRAQ法（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）代謝標記法：（1）15N標記法（2）細胞培養中含有穩定同位素的氨基酸標記法（SILAC)第10頁/共30頁

ICAT試劑有三部分組成，有兩種形式，稱為“重”和“輕”

重型（含8個氘）輕型（不含氘）。

第一親和標簽（生物素），用來分離經標記后的多肽；第二連接子，用來整合穩定的同位素；第三活性基團，用來特異結合巰基。同位素親和標簽技術（ICAT法，isotope-codedaffinitytags）第11頁/共30頁ICAT標記定量技術流程兩種蛋白質分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標記標記后等量混合，胰蛋白酶酶切親和純化得到ICAT標記的多肽質譜分析，依據MS質譜峰圖強度進行定量，MS/MS鑒定肽段第12頁/共30頁ICAT法的缺點（1）它不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質。

（2）ICAT分子量相對較大（約500Da）與蛋白質連接后可能會造成分子的空間位阻對小肽而言是一個較大的修飾物，會增加數據庫搜索的復雜性第13頁/共30頁同重標簽標記的相對和絕對定量

(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)由美國ABI公司2004年開發的技術。第14頁/共30頁iTRAQ試劑標記原理

報告部分：共有8種：質量數分別為114~121Da，最多可同時標記8組樣品。

肽反應部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側鏈發生共價連接，從而將報告部分和平衡部位標記到肽段上。平衡部分：質量數分別為31~24Da，與報告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標記的不同樣本的同一肽段具有相同的質荷比。第15頁/共30頁iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基）連接的胺標記同重元素。在一級質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在一級質譜中，不同來源的相同肽段表現為一個峰；在二級質譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團發生中性丟失，信號離子表現為不同質荷比(114～121)的峰，因此根據波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異；同時，肽段的MS/MS結果結合數據庫檢索可以鑒定出相應的蛋白種類。第16頁/共30頁第17頁/共30頁iTRAQ實驗流程1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質；

2：蛋白質經過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標記；

4：等量混合各樣本中的標記肽段；

5：MS/MS質譜檢測及分析。第18頁/共30頁iTRAQ技術優勢靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同時對8個樣本進行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；結果可靠：定性與定量同步進行，同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息；自動化程度高：液質連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。第19頁/共30頁Label-free指無標簽標記的定量蛋白質組學研究，依賴于繁雜的信息分析完成定量過程，主要有兩種：

信號強度法：根據一級質譜相關的肽段峰強度（Massspectralpeakintensity）、峰面積（Peakarea）、液相色譜保留時間（LCretentiontime）等信息進行定量分析；

譜圖計數法：根據二級質譜相關的每個蛋白鑒定到的肽段總次數（Peptidehide或Spectralcounts）、所鑒定肽段的離子價位（Ioncountsofidentifiedpeptides）等信息進行定量分析。第20頁/共30頁將質譜數據由譜峰形式轉化為直觀的類似雙向凝膠的圖譜，譜圖上每一個點代表一個肽段，再比較不同樣本相應肽段的強度，從而對肽段對應的蛋白質經行相對定量。第21頁/共30頁優點：無標記定量技術與同位素標記定量技術相比，實驗成本低，不需要購買昂貴的同位素標記試劑。缺點：不能將不同樣品同時進行質譜分析，實驗操作比較繁瑣。需要更高的數據分析處理方法。第22頁/共30頁代謝標記法—15N標記法簡介：在培養基中添加15N，細胞經過若干代培養后，蛋白質將完全被同位素標記，等量混合標記與沒有標記同位素的樣本、液相色譜和SDS分離，質譜鑒定和定量。根據質譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。第23頁/共30頁優點：高效性：15N標記法是體內標記技術，標記效率可高達95%；重現性：降低由于樣品制備不同而造成的實驗內差異；靈活性：在培養基中添加同位素標記15N，操作方便。缺點：

（1）只有已知蛋白質的氨基酸序列，才可以對14N/15N標記的蛋白質或肽段的相應質量位移進行預測。（2）由于使用的15N培養基純度>96%，無法完全置換14N,所以15N標記的肽段在質譜中會有額外的同位素峰。第24頁/共30頁SILAC即細胞培養條件下穩定同位素標記技術(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)

原理是在細胞培養時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養基進行細胞培養，用于SILAC主要的穩定同位素氨基酸是Lys和Arg,細胞在傳代培養過程中同位素氨基酸將被細胞用于合成蛋白質，細胞經傳代培養5-6代后，細胞的所有蛋白質將被同位素標記，等量混合標記的蛋白質后經過SDS分離和質譜分析，通過比較一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。第25頁/共30頁代謝標記法—SILAC1、標記：在缺乏Lys和Arg的培養基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培養細胞，使蛋白質被標記成“中型”或“重型”；

2、細胞處理，如藥物處理；

3、細胞裂解、提取蛋白質；

4、等量混合對照與處理組蛋白質、SDS電泳、染色；

5、割取蛋白質條帶，胰蛋白酶消化，質譜分析。第26頁/共30頁SILAC相對于iCAT有著更高的精確性，而且不需要復雜的化學過程和純化步驟保證了樣品相似的實驗條件。然而SILAC不能用于臨床的組織和血液標本。