關于分子生物學常用技術第一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日分子生物學常用技術凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(PCR)技術DNA的物理圖譜DNA序列測定基因芯片第二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第一節凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質粘度

第三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

第四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點應用范圍第五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（一）分離核酸原理

電荷效應

分子篩效應

分子構象第六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日1.電荷效應核酸是兩性電解質

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負電荷，正極第七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2.分子篩效應小分子移動快，大分子移動慢第九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日3.分子構象閉環超螺旋>線狀DNA>開環DNA

+-第十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（二）操作要點支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標準電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收第十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日1.支持物第十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日商品化的瓊脂糖第十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機械強度中差高高分辨率中差中高第十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2.凝膠濃度的選擇第十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日凝膠的制備第十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日3.DNAmarker第十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日DNAmarker第二十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日DNA長度標準曲線第二十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

第二十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日5.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍/二甲苯青

第二十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日點樣第二十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日6.電泳條件潛水電泳恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃

第二十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日潛水電泳第二十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結構及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結束后染色第二十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日EB染色原理第二十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第二十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日紫外燈下顯色第三十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日8.DNA片段的回收低熔點瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)第三十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（三）應用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產物的分離鑒定第三十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日瓊脂糖凝膠電泳第三十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點優點應用范圍第三十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（一）分離原理電荷效應分子篩效應第三十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)第三十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日聚丙烯酰胺凝膠第三十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（二）操作要點凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測DNA片段的回收第三十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日1.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS第三十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2.凝膠濃度的選擇第四十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第四十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日3.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第四十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日PAGE裝置第四十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第四十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第四十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第四十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日電泳第四十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日4.凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

第四十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日5.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低第四十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（三）PAGE優點機械強度好、化學穩定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

第五十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日（四）PAGE應用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產物鑒定蛋白質的檢測和分析第五十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第二節分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術第五十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復性第五十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日分子雜交DNA-DNA第五十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日DNA-RNA第五十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日雜交條件靶分子探針雜交袋雜交爐第五十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日雜交種類被檢核酸種類和方法原位雜交斑點雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應介質液相雜交固相雜交()第五十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日二、固相支持物固相支持物的特性結合能力強不影響雜交反應結合牢固非特異性吸附少機械性能良好

第五十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)第五十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日1.硝酸纖維素濾膜

特點吸附ssDNA和RNA

雜交信號本底低不足不適于重復雜交濾膜較脆不適于電轉移印跡法對DNA小片段(<200bp)結合能力弱第六十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2.尼龍膜特點結合能力強

可反復雜交

韌性強

適于電轉移印跡法對DNA小片段(10bp)結合能力強不足雜交信號本底較高

第六十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日分子生物學考試時間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點：逸夫樓3樓生化實驗室第六十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日三、探針(probe)探針的概念探針的類型

標記物的種類標記方法第六十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日1.探針的概念特異結合和檢測靶分子的活性物質抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA第六十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2.探針的類型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質或多肽探針第六十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日3.標記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標記物生物素地高辛熒光素酶

第六十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日4.核酸探針的放射性標記方法

DNA缺口平移標記法隨機引物標記法

DNA的5’末端標記

第六十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日缺口翻譯特點均一標記制備dsDNA探針第六十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日隨機引物標記法(randompriming)

隨機引物6nt含有各種可能的排列順序特點放射比活性>缺口翻譯操作簡便DNA/cDNA探針第六十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第七十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日DNA的5’末端標記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

第七十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日DNA的5’末端標記第七十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

第七十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日1.印跡的方法

毛細管轉移法

電轉移法

真空轉移法

第七十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日毛細管轉移法第七十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日電轉移法第七十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日真空轉移法第七十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第七十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2.Southern雜交的步驟第七十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日3.Southern雜交的應用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP第八十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉移→雜交→放射自顯影/化學顯色

應用檢測組織/細胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細胞中基因的表達情況

第八十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日Northern雜交第八十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉移→蛋白－第一抗體→標記的第二抗體(探針)→檢測

應用蛋白質的定性定量分析第八十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第八十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日免疫印跡第八十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日

Southern,Northern&Western

待測物質

支持物

探針

轉移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細管/電/真空

Western

蛋白質NC/PVDF

抗體電轉移

第八十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類細胞內原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細胞/組織固定預雜交雜交沖洗雜交信號檢測分析結果

第八十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日組織切片第八十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第八十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日八、斑點雜交

(dothybridization)

第九十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第三節PCR技術聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發展簡史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應用第九十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日一、PCR的發展簡史1971年,Korana提出核酸體外擴增的設想1985年,Mullis等發明了PCR技術1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺PCR儀第九十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復制三個步驟變性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

第九十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日PCR的原理第九十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日PCR的擴增產物cycle

12345n長片段

246810短片段

002822長＋短

21222324252n第九十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日標準的PCR反應體系10X擴增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul第九十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第九十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環條件

第九十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日模板

DNARNAcDNA對模板的純度要求低第九十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日引物長度：15～30nt

G+C含量：40~60%

堿基的隨機分布避免引物自身和引物之間的互補引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L

第一百頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

第一百零一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日底物4種dNTP

的濃度相等終濃度：200umol/L

第一百零二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L

過高:非特異擴增

過低:反應產物減少第一百零三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日循環條件變性溫度和時間:90~96℃,30~60s退火溫度和時間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環次數:25～35

第一百零四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日四、PCR的種類反轉錄PCR原位PCR(insituPCR)實時PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)第一百零五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴增→原位雜交及檢測

第一百零六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日實時PCR的原理第一百零七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日五、PCR的應用分子生物學研究臨床醫學第一百零八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日分子生物學研究基因克隆

DNA序列測定基因的體外定點突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

第一百零九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日臨床醫學病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測

法醫學

第一百一十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日第四節DNA序列測定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學裂解法(1977)第一百一十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復制

反應條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標記）

ddNTP

DNA聚合酶第一百一十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日DNA的復制第一百一十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期日2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)