基因工程抗體及其發展前景第一頁，共七十四頁，2022年，8月28日主要內容第一節:基因工程抗體的基本原理：第二節:人源化抗體制備的主要方法：第三節:抗體靶向治療的新的思考：第四節:工程抗體的未來發展與展望：第二頁，共七十四頁，2022年，8月28日第一節：基因工程抗體的基本原理

(antibodyengineering）第三頁，共七十四頁，2022年，8月28日Antibodyhasahigherspecificityandaffinitytobindtotargetprotein.

藥物(drug)：是一類分子（化學合成物，蛋白質，核酸等）可以干擾人體內細胞生命過程中一些重要的生理和病理活動或通路。第四頁，共七十四頁，2022年，8月28日基因抗體：通過基因工程手段，保留抗體重輕鏈可變區中主要與抗原結合的CDR功能區,而形成的各種功能抗體．Complementary-determiningregions:CDR第五頁，共七十四頁，2022年，8月28日基因工程抗體的分類第六頁，共七十四頁，2022年，8月28日基因工程抗體的分類2.小分子抗體（1）Fab片段（2）單鏈抗體（singlechainantibody，scFv）、雙鏈抗體、三鏈抗體（3）微型抗體（minibody，兩個scFv與抗體CH3區連接）（4）雙特異性抗體（diabody）（5）其他形式抗體（細胞內抗體、催化抗體、免疫脂質體、最小結合單位等）第七頁，共七十四頁，2022年，8月28日抗體藥物在應用中存在的問題：一般必須用小鼠骨髓瘤制備單抗，故所得鼠源性單抗，必須人源化，在臨床上可減少異源性蛋白所引起的過敏反應和增加療效。鼠源抗體人源化后，抗體效價明顯降低，導致臨床療效降低。臨床治療需要大量的抗體(克級），故需要生物反應器制備抗體。由于抗體的產量和質量受到限制，而影響療效。問題:工程細胞系,大規模生產工藝技術第八頁，共七十四頁，2022年，8月28日基因工程抗體的優點和缺點優點：不受動物品系（species)和抗體類型（isotype)的限制。利用嵌合抗體，使鼠源抗體人源化，減少潛在的抗原表位，增強抗體的療效。全人源化抗體，可以降低抗體的異源性和免疫源性，最大化提升抗體的的療效。缺點：抗體的親和力減弱，與完整抗體結構相比，功能明顯降低。第九頁，共七十四頁，2022年，8月28日目的：減小鼠源性成份，降低HAMS反應（humanagainstmousesyndrome)。易于大規模生產和應用于臨床。保留抗體的抗原結合能力。基本原理：借助基因工程手段，將編碼Ab的重輕鏈可變區基因重組到真核表達載體上并進行表達。第十頁，共七十四頁，2022年，8月28日基因工程抗體的表達原核細胞和酵母可以用于表達小分子抗體和抗體片段大部分完整抗體和雙鏈抗體、微型抗體等需要在CHO等哺乳動物細胞中表達利用完整的動植物體通過轉基因的方法表達外源蛋白：如利用轉基因煙草生產抗狂犬病毒抗體第十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日抗體工程的發展歷程動物多克隆抗血清被抗生素所代替成份復雜，副反應嚴重鼠源單克隆抗體1975年，雜交瘤技術制備單抗成功“魔彈”HAMA反應20世紀90年代初，抗內毒素單抗用于治療膿毒敗血癥遭遇失敗。抗體藥物的研究進入低谷。分子生物學基因工程技術基因工程抗體鼠源抗體的人源化及形式多樣的改造抗體抗體工程就是指利用分子生物學、基因工程等手段對抗體進行各種不同的改造并在原核、真核細胞中表達制備的工程技術。馬血清,破傷風,狂犬病第十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日TheEvolutionofTherapeuticAntibodiesMurineFullyHumanHumanizedChimeric100%mouseprotein34%mouseprotein5-10%mouseprotein100%humanproteinPotentialforImmunogenicityHighLowLonbergN.NatBiotechnol.2005;23:1117-1125.TernantD,etal.ExpertOpinBiolTher.2005;5(Suppl1):S37-S47.

YangX-D,etal.CritRevOncolHematol.2001;38:17-23.WeinerLM.JImmunother.2006;29:1-9..嵌合抗體人源化抗體全人抗體第十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日第二節：基因工程抗體制備的主要方法：第十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日1.人鼠嵌合抗體

（ChimericAntibodies）原理：利用基因重組技術，把鼠抗體的重輕鏈可變區部分與人抗體重輕鏈恒定區的進行重組，減少鼠源結構，增加人源結構，而保持抗體與原抗原的特異性結合。缺點：鼠抗體部分亦能作為一種異種抗原，多次反復使用在人體產生抗體及過敏反應（HAMS反應，humanagainstmousesyndrome)。嵌合抗體可保持特異性結合和外源性抗原降低，但親和力明顯下降。第十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日Chimericantibodies雜交瘤細胞株獲得兩個可變區克隆載體(T載體)原核表達系統檢測構建表達載體RT-PCR酶切測序酶切，連接轉化是是否否酶切，連接1。獲得鼠單抗重輕鏈可

變區的基因片段。2.基因片段插入含有人IgG重輕鏈恒定區的表達載體。第十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日人鼠嵌合抗體的真核表達在CHO細胞（共轉染模式和單載體轉染模式）

第十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日Until2003,7，8437peoplehavebeeninfectedwithSARSoverthe32countries,inwhich813patientswerediedformdisease.Thediseaseincidenceisabout10.5%.Therearemanyunresolvedquestionsaboutdiseasepathogenesis,treatmentanddiagnosis.第十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日2.humanizedantibodies"Humanization"or"reshaping"ofmurineantibodiesisanattempttotransferthefullantigenspecificityandbindingavidityofmurinemonoclonalantibodiestoahumanantibodybygraftingthemurinecomplementaritydeterminingregions(CDRs)ontoahumanvariableregionframework。保留鼠CDR的人源化Ab65to90%第二十頁，共七十四頁，2022年，8月28日MouseHumanHumanisedhypervariableframework第二十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日humanization-CDRgrafting

CDRresiduesfromvariableregionofamousemAbaretransferredtohumanantibodyframeworksthathavehighsequencehomologywiththemousecounterparts第二十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日HumanizedAntibodiesAllowsspecificityAllowseffectorfunctionsLessimmunogenic第二十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日humanization-advantageMurinemAbshavebeenextensivelycharacterizedandhavedesirableantiviralpropertiesand/orsuperiorfullyhumanmAbsarehardtoobtain.Thisviableapproachistheclassicandsimpleststrategy

ofhumanizationamongmanyotheravailablestrategies,suchasgraftingspecificitydeterminingresidues17.ThefactthatnearlyhalfofallUSFoodandDrugAdministration

(FDA)-approvedtherapeuticmAbsarehumanizedantibodiestestifiestotheirsafetyandtolerancebyhumans.第二十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日3。FullyhumanmAbs

1）。transgenicmice2）。Humanantibody-displaylibraries3）。TomakeHumanmAbfromhumanbeing全人抗體100%第二十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日1）Transgenicmice首先把小鼠編碼Ig重輕鏈的基因剔除。制備表達人的Ig重輕鏈的轉基因小鼠。上二種小鼠回交，獲得只表達人Ig重輕鏈的基因的小鼠。當用抗原免疫后，小鼠可產生完全人源抗體。第二十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日CreationofFullyHumanmAbsFromTransgenicMiceReplacemurineimmunoglobulin(Ig)GgeneswithhumanIgGgenesWeinerLM.JImmunother.2006;29:1-9.YangX-D,etal.CritRevOncolHematol.2001;38:17-23.MousestrainincapableofproducingmouseantibodiesHumanIglociBreedingBreedingMouseembryonicstemcellscontaininghumanantibodygenesMousestrainproducinghumanandmouseantibodiesMouseembryonicstemcellswithinactivatedmouseheavyandlightchainlociMouseIglociMousestrainproducingonlyhumanantibodies第二十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日Transgenicmouse-advantageHavearepertoireoffullyhumanIgG1gaveresearchersanalternativeroutetohumanmAbsthroughactiveimmunization,withouttheprotocolrestrictionsassociatedwithhumanstudies.第二十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日Transgenicmouse-drawbacksAstheimmuneresponseintransgenicmiceissometimeslessrobustthaninstrainsthatareusedtogeneratemousemAbs,moreimmunizationsorantibodyscreensareoften

required.Thesetransgenicmicecannotexactlyreproducethehumanantibodyresponsebecauseofrepertoiredifferencesandbecausethegeneticbackgroundofthemurinehostaffectsantigenprocessing,B-cellontologyandregulation(e.g.,tolerancemechanisms).Atpresent,thesetransgenicmiceareprotectedintellectualpropertyandthereforenotcommonlyavailable第二十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日2）噬菌體抗體庫技術

(Phageantibodylibrarytechnique)把人的Ig重輕鏈可變區基因片段展示在l噬菌體表面,組成抗體庫。通過噬菌體把抗體的表型和基因型相偶聯，易進行分子克隆和基因操作。抗體庫的來源影響篩選結果（免疫和正常人）。高通量篩選與抗原結合的抗體，但親和力低。第三十頁，共七十四頁，2022年，8月28日scFv---single-chainvariablefragments第三十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日Displaytechnologies-strategy第三十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日PhageDisplayLibrary-Antibodylibrary-fromImmunologyToday(2000),21,371-378第三十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日FlowchartofPhageDisplayApplicationDisplayingTargetsonFilamentousPhagePanning(Selection)ofThePhageLibraryExpressiontheProteinFragmentorIsolationofAffinity-PurifiedPhageClonesLibraryclonesExpressionIsolation第三十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日StartfromhumangenesNewspecificities?Lessimmunogenic?CanscreenalargerrepertoireLossofcombinatorialspecificitiesBypassimmunisation–naivelibraryLowaffinityAffinitymaturationinvitroExtrasteps,moreimmunogenic?Economicalproductioninbacteria

OnlyfragmentsPhageDisplay-advantages第三十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日PhageDisplay-drawbackUnnaturalpairingsoftheantibodyheavyandlightchaincomponentsThemethodofpresentationofantigenasbaitforpanningmayaffectthenumberanddistributionofavailableneutralizingepitopes.第三十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日Na?veorimmunizedKeypointFunctionalAb第三十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日3）用人的骨髓瘤細胞直接制備

全人抗體關鍵點：建立好的人骨髓瘤細胞。穩定性高和融合率高。(Humanantibodies2002,11:85-96)第三十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日MousemyelomaHumanmyelomaDoubleselectingmarkers

G418andHATHumanLNBcells第三十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日BreastcancertissueBreastcancercellsWeworkonHCV/E2mAbandRabbisvirusSproteinbyusingFMP2cells.第四十頁，共七十四頁，2022年，8月28日4.B細胞永生化技術：用EB病毒將人淋巴細胞永生化可產生分泌抗體的B細胞克隆。這一技術較為成熟，但是存在抗體分泌不穩定的缺點，限制了其應用。或直接分離分泌抗體的B細胞,用PCR獲得重輕連,構建全人抗體.第四十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日Bcellimmortalization:EBVTransformationEpstein-BarrvirusWhenEBVinfectsB-lymphocytesinvitro,lymphoblastoidcelllineseventuallyemergethatarecapableofindefinitegrowth.Thegrowthtransformationofthesecelllinesistheconsequenceofviralproteinexpression.第四十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日BcellimmortalizationMemoryB-cellsareobtainedfromthebloodofanindividualrecoveringfromavirusinfection.Therebyobviatingtheneedforafusionsteptogeneratehybridcells,asinthehybridomatechnique.第四十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日MemoryB-cellimmortalizationMemoryBcellsisolatedfromPBMCImmortalizedbyEBVinthepresenceofaCpGoligodeoxynucleotideandirradiatedallogeneicPBMCs第四十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日RelatedpaperMemoryB-cellsisolatedfromthebloodofindividualswhohaverecoveredfromSARS-CoVandH5N1avianinfluenzainfectionshavebeenimmortalizedusingthismethodtoproduce

nAbsagainsttheseviruses.Traggiai,E.etal.AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus.

Nat.Med.10,871–875(2004).Simmons,C.P.etal.ProphylacticandtherapeuticefficacyofhumanmonoclonalantibodiesagainstH5N1influenza.PLoSMed.4,178(2007).第四十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日５．SingleBcellRT-PCRNatureBiotechnology,2008,26:886-887.第四十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日thestrategyofsinglecellRT-PCR第四十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日Thetimeframe-onemonth第四十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日各種全人抗體生產技術比較優點缺點微生物表面展示技術很成熟，體外進行抗體親和力的完善，抗體的重輕鏈不是天然配對，沒有在體外還原天然抗體的構象轉基因小鼠可以產生全人免疫球蛋白庫，不受到人體試驗的限制轉基因老鼠還是并不能生產精確的全人抗體EBV病毒轉化EBV病毒轉化產生的B細胞雜交瘤用于產生中和抗體，材料來源廣泛B細胞雜交瘤存在染色體不穩定，易丟失的缺陷單個B細胞RT-PCR方便，常規分子克隆實驗條件快速，條件優化后僅需要30天高通量，針對抗原特異抗體庫親和力和特異性：親和力很高，獲得針對抗原各表位的抗體適用通過疫苗治療的各種疾病慢期炎癥或致死性病原體如HIV，癌癥和自身免疫病方面應用受到限制第四十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日Sourceofantibodiesonthemarket

(accordingtoa“marketanalyst”)SourceAntigenicity%HumanMouse+++0%Chimeric+60-70%Humanised->90%Human-100%第五十頁，共七十四頁，2022年，8月28日第三節：抗體靶向治療的新思考問題1：在臨床上抗體用量大（幾百毫克到克級），價格昂貴。在不發達國家難于承受。問題2：由于專利限制，中國難于進行metoo藥仿制。解決方案：能否利用中和性抗體的靶向作用，確定抗體作用的靶點位子，用小分子替代，設計新藥？第五十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日SinceaneutralizedmAbisvaluableindiseasetreatment,thetechniquesusedhereallowustoidentifycorefunctionalregionsofgivenreceptor/ligand.therefore,thereisapotentialtodesignrationalmimickingmoleculesbasedontheidentifiedregion.DefiningthefunctionalregionofligandorreceptorrecognizedbyneutralizingmAbwillbeessentialinidentifyingnoveldrugtargets.Prospective展望第五十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日抗體藥物發展現狀FDA已批準上市的抗體藥物SFDA(中國)已批準上市及臨床研究的的抗體藥物第五十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日第五十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日第五十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日第四節：工程抗體的未來發展與展望1.單克隆抗體的市場需求第五十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日

對2004—2011年全球治療單抗市場的預測及分析第五十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日2.抗體藥物的應用領域抗器官移植排斥反應；腫瘤導向治療；哮喘、銀屑病、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發性硬化癥及其他自身免疫性疾病；心腦血管疾病；感染性疾病；其他第五十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日四種抗體的臨床應用概況第五十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十四頁，2022年，8月28日第六十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日第六十二頁，共七十四頁，202