第十三章

PCR核酸擴(kuò)增儀

(PCRnucleicacidAmplifier)教學(xué)基本要求掌握核酸擴(kuò)增儀的工作原理和主要性能指標(biāo)。掌握梯度PCR儀和原位PCR儀的功能和特點。掌握實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀的種類及特點。熟悉PCR技術(shù)的原理；PCR擴(kuò)增儀的種類；熒光實時定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)原理。了解PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程；PCR擴(kuò)增儀常見故障的排除；PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用。內(nèi)容提要第一節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的工作原理第二節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)第三節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)

程及常見故障的排除第四節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的臨床應(yīng)用第一節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的工作原理PCR技術(shù)的發(fā)展簡史PCR技術(shù)的原理核酸擴(kuò)增儀的工作原理PCR技術(shù)的發(fā)展簡史

1953年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)1963年，建立了核酸測序的方法

1971年Khorana最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。PCR技術(shù)的發(fā)展簡史1971年，KjellKleppe等描述的一項基于酶的體外DNA復(fù)制實驗

。

1985年美國PE公司KaryMullis在開車前去北加利福尼亞紅樹縣的一條被月光籠罩的山路上構(gòu)思了PCR。1993年，Mullis因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)的發(fā)展簡史

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow（克列諾）片段，該片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。PCR技術(shù)的發(fā)展簡史1988年，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。KeohanogKaryMullisSaikiPCR技術(shù)的發(fā)展簡史PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是核酸體外擴(kuò)增加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25～40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴(kuò)大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。PCR技術(shù)的原理PCR循環(huán)–

第一步–加熱變性PCR技術(shù)的原理PCR循環(huán)-

第二步–引物與模板DNA分子退火Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’PCR技術(shù)的原理PCR循環(huán)-

第三步-引物延伸Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR技術(shù)的原理第1個PCR循環(huán)完成后

——得到兩個拷貝的靶序列PCR技術(shù)的原理30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量循環(huán)數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,824PCR核酸擴(kuò)增儀的工作原理PCR核酸擴(kuò)增儀的工作關(guān)鍵是：溫度控制PCR核酸擴(kuò)增儀的工作原理控溫方式離心式空氣加熱控溫

半導(dǎo)體控溫

壓縮機(jī)控溫

水浴鍋控溫

PCR儀的控溫方式水浴鍋控溫：第一代壓縮機(jī)控溫：第二代，金屬導(dǎo)熱，邊緣效應(yīng)及overshooting和undershooting現(xiàn)象半導(dǎo)體控溫和離心式空氣加熱控溫：第三代第二節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)PCR擴(kuò)增儀的種類

原位PCR儀

梯度PCR儀

實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀

普通PCR擴(kuò)增儀

普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀按照變溫方式分為以下三類：水浴式PCR儀變溫金屬塊式PCR儀變溫氣流式PCR儀

普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀

——水浴式PCR儀一般由三個不同溫度的水浴槽和機(jī)械臂組成。采用半導(dǎo)體傳感技術(shù)、電子技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)進(jìn)行水浴溫度的測量、顯示和控制并經(jīng)計算機(jī)控制由機(jī)械臂完成樣品在每個水浴槽的置放以及槽間的移動。特點：儀器體積較大，但變溫快、時間準(zhǔn)、溫度均一，目前國內(nèi)應(yīng)用較少。

普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀

——變溫金屬塊式PCR儀中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數(shù)目甚至不同規(guī)格的凹孔，用來放置樣品管。凹孔內(nèi)壁加工精密，保證與樣品管緊密接觸。一般通過半導(dǎo)體加熱和冷卻，并由微機(jī)控制恒溫和冷熱處理過程，通過鍵盤和顯示器實現(xiàn)人機(jī)交流，并可編程、存儲或刪除程序。特點：儀器裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩(wěn)，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀

——變溫氣流式PCR儀由機(jī)殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成。熱源由電阻元件和吹風(fēng)機(jī)組成，形成熱空氣槍借空氣作為熱傳播媒介，由大功率風(fēng)扇及制冷設(shè)備提供外部冷空氣制冷，精確的溫度傳感器構(gòu)成不同的溫度循環(huán)。特點：儀器不用金屬精密加工，成本較低；整個系統(tǒng)沒有液體流動及制冷劑，安全程度高。配上微機(jī)和軟件，可靈活編程。

普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀按照功能用途可分為以下兩類：梯度PCR儀原位PCR儀

普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀

——梯度PCR儀由普通PCR儀衍生出的具溫度梯度功能的核酸擴(kuò)增儀。多種變性溫度和延伸溫度可在一臺擴(kuò)增儀上同時完成既節(jié)省實驗時間、提高實驗效率，又節(jié)約實驗成本。梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，一步就可以摸索出最適退火條件。

普通定性PCR核酸擴(kuò)增儀

——原位PCR儀

是原位雜交與PCR技術(shù)的結(jié)合。在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而不破壞組織細(xì)胞的形態(tài)。解決了以往手工方法操作復(fù)雜，擴(kuò)增效果及實驗結(jié)果重復(fù)性不理想的問題。與普通PCR儀的區(qū)別：其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內(nèi)可垂直放置一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，溫度傳導(dǎo)極佳，控溫很精確。實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR，RQ-PCR)技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號達(dá)到定量的目的。實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀由兩部分組成：PCR系統(tǒng)和熒光檢測系統(tǒng)。熒光檢測系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測器，現(xiàn)在的主流是多色多通道檢測，激發(fā)通道越多適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬。熒光檢測（二）熒光檢測系統(tǒng)

激發(fā)光源

檢測器

發(fā)光二極管

鹵鎢燈光源

超低溫CCD

光電倍增管實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀金屬板式實時熒光定量PCR儀離心式實時熒光定量PCR儀各孔獨立控溫的定量PCR儀金屬板式實時熒光定量PCR儀即傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀，由第三代的半導(dǎo)體PCR儀發(fā)展而來，在原位PCR儀的基礎(chǔ)上，增加熒光激發(fā)和檢測模塊，升級為熒光定量PCR儀。可作普通PCR儀使用，帶梯度功能，但溫度均一性差，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致。

金屬板式實時熒光定量PCR儀激發(fā)光源多為鹵鎢燈，與5色濾光鏡配合，可同時激發(fā)96或384個樣品；檢測器為超低溫CCD成像系統(tǒng)，可同時多點多色檢測，能有效分辨FAM／SYBRGreenI、VIC／JOE、NED／TAMRA／Cy3等多種熒光染料。隨機(jī)配制的定量PCR引物和探針設(shè)計軟件PrimerExpress可以設(shè)計定量PCR所需的TaqMan探針。有實時動態(tài)(Real-Time)和終點讀板(PlateRead)兩種模式。實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀金屬板式實時熒光定量PCR儀離心式實時定量PCR儀

各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀

離心式實時定量PCR儀離心式實時定量PCR儀器的樣品槽被設(shè)計為離心轉(zhuǎn)子的模樣，借助空氣加熱，轉(zhuǎn)子在腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，每個樣品孔之間的溫度差異小于0.01℃，保障了標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間反應(yīng)條件的一致性。激發(fā)光源大多采用發(fā)光二極管(LED)冷光源，運(yùn)行前無需預(yù)熱，無需校正。系統(tǒng)誤差少，定量線性范圍可達(dá)l0個數(shù)量級。缺點：離心轉(zhuǎn)子小，可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能。

離心式實時定量PCR儀Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀

LightCycleTM熒光定量PCR儀

離心式實時定量PCR儀LightCycleTM熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

實時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀金屬板式實時熒光定量PCR儀離心式實時定量PCR儀各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀

各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀各孔獨立控溫的定量PCR儀設(shè)計非常獨到，不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，可以在同一臺定量PCR儀上分進(jìn)行不同條件的定量PCR反應(yīng)，隨時利用空置的樣品槽開始其他定量反應(yīng)，使用效率非常高。升降溫速度高達(dá)10℃／s，控溫精度高。每個模塊獨立控制的激發(fā)光源和檢測器直接與反應(yīng)管壁接觸，保證熒光激發(fā)和檢測不受外界干擾。各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀該類儀器整合多通道光學(xué)檢測系統(tǒng)，能有效分辨多種熒光染料，可對同一樣品進(jìn)行多靶點分析，同時檢測四種熒光信號。可使用Taqman探針、分子信標(biāo)、Amplifluor引物等多種檢測方法，定量線性范圍可達(dá)9個數(shù)量級。其軟件允許一臺儀器同時操作多個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運(yùn)用，還可實現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。缺點：上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。適合多指標(biāo)快速檢測，但目前在國內(nèi)應(yīng)用尚少。第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀第三節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程

及常見故障的排除PCR核酸擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)PCR核酸擴(kuò)增儀的操作規(guī)程PCR核酸擴(kuò)增儀常見故障的排除PCR核酸擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)性能指標(biāo)其他

軟件功能基座容量和樣品數(shù)熒光檢測

熒光檢測范圍檢測通道數(shù)量CT值重復(fù)性誤差溫度控制

溫度的均一性升降溫的速度不同模式下的相同溫度特性熱蓋溫度溫度的準(zhǔn)確性溫度控制溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，是PCR反應(yīng)最重要的影響因素之一，直接關(guān)系到實驗的成敗。溫度的均一性是指樣品孔間的溫度差異，關(guān)系到不同樣品孔之間反應(yīng)結(jié)果的一致性。如：“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。升降溫的速度升降溫速度快，能縮短反應(yīng)進(jìn)行的時間，提高工作效率，提高PCR反應(yīng)特異性。溫度控制升降溫的速度升降溫速度快，能縮短反應(yīng)進(jìn)行的時間，提高工作效率，提高PCR反應(yīng)特異性。

熱蓋溫度熱蓋可使樣品管頂部溫度達(dá)到105℃左右，避免蒸發(fā)而改變PCR反應(yīng)體積，無需再向反應(yīng)管內(nèi)添加石蠟油，減少了后續(xù)實驗的麻煩。

熒光檢測CT值重復(fù)性誤差

熒光檢測范圍

檢測通道數(shù)量

Ct值得重復(fù)性誤差Ct值得含義：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系要求Ct值的CV小于或等于2.5%典型“S”型曲線指數(shù)起始期、擴(kuò)增期、平臺期三期明顯Ct值的意義：擴(kuò)增達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)

Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時進(jìn)行96次擴(kuò)增FQ-PCRCt值與濃度不同的模板達(dá)到熒光域值時的Ct值不同熒光檢測范圍PCR是一個指數(shù)級擴(kuò)增的過程，微量的起始拷貝數(shù)不同，經(jīng)過幾十過循環(huán)后，其熒光差別將十分巨大。熒光檢測要求范圍：10-1010檢測的通道數(shù)量復(fù)合PCR實驗已成為一種流行趨勢，要求儀器具有多通道檢測能力。目前的PCR儀4通道檢測的居多，部分儀器具有6個檢測通道。其他

常用樣品管：0.2、0.5mlPCR管；8、12聯(lián)排管；96孔微孔板等

其他

新型的PCR儀都常規(guī)使用優(yōu)質(zhì)配套軟件，此類軟件易學(xué)易用，還具有實時信息顯示、記憶存儲多個程序，及自動倒計時、自動斷電保護(hù)等功能，很多儀器還可以免費升級。第三節(jié)

PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)

PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程

PCR擴(kuò)增儀的常見故障的排除PCR核酸擴(kuò)增儀的操作規(guī)程普通PCR擴(kuò)增儀的操作非常簡便，接通電源，儀器自檢，按照程序設(shè)置溫度或調(diào)出儲存的程序運(yùn)行即可。定量PCR擴(kuò)增儀的操作和普通PCR儀基本相同。第三節(jié)

PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)

PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程

PCR擴(kuò)增儀的常見故障的排除PCR核酸擴(kuò)增儀常見故障的排除熒光染料污染樣品孔：請工程師清潔樣品孔；PCR管融化：可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題，需工程師檢修；個別孔擴(kuò)增效率差異很大：可能的原因是半導(dǎo)體模塊出現(xiàn)壞點，需工程師檢修；PCR核酸擴(kuò)增儀常見故障的排除熒光強(qiáng)度減弱或不穩(wěn)定：原因有濾光片發(fā)霉或有水汽等，需工程師檢修；或光源損耗需更換光源；或需調(diào)節(jié)檢測元件靈敏度，也需工程師調(diào)試；儀器工作時出現(xiàn)噪聲：可能的原因是PCR管沒有放好；或風(fēng)扇松動，需工程師檢修；PCR核酸擴(kuò)增儀常見故障的排除儀器采集熒光時有不正常的噪聲：某些光纖傳導(dǎo)信號的定量PCR儀可能出現(xiàn)這一問題，需工程師檢修或更換配件；機(jī)器搬動后不能正常工作或不能正常采集熒光信號對于某些光路系統(tǒng)復(fù)雜的儀器，應(yīng)盡量避免自行搬動儀器。出現(xiàn)這種情況后需工程師重新調(diào)試;PCR反應(yīng)假陰性原因很多，其中PCR儀控溫不準(zhǔn)也是一個重要原因，可使用電子測溫儀校準(zhǔn)溫度