六層析分離是利用混合物中各組分的物理化學性質（分子大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數等）的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達到分離。層析分離中一個相是固定的,稱為固定相;另一個相是流動的,稱為流動相;各組分移動速度步同,使不同組分分純化;層析分離設備簡單,操作容易;層析分離層析柱當前1頁，總共69頁。表4-5層析分離方法層析方法分離依據吸附層析吸附力不同分配層析各組分在兩相中分配系數不同離子交換層析離子交換劑上解離基團對離子親和力不同凝膠層析各組分相對分子量不同親和層析生物分子與配基間專一又可逆親和力層析聚焦等電特性與離子交換層析特性結合當前2頁，總共69頁。一、吸附層析(link)二、分配層析(link)三、離子交換層析(link)四、凝膠層析(link)五、親和層析(link)附：視頻動畫1、色譜柱2、液相色譜生產上常用的層析分離方法go當前3頁，總共69頁。一、吸附層析一個相中的物質在兩相界面上密集現象稱為吸附；吸附產生原因：固體表面分子與固體內部分子受的作用力不同；主要是范德華力。常用于酶分離純化的：硅藻土、氯化鋁、磷酸鈣、羥基磷灰石、活性碳。不同物質吸附力、解析力不同，移動距離不同，而分離。利用吸附劑對不同物質的吸附力不同，而使混合液中各組分分離。１、吸附層析原理當前4頁，總共69頁。２、洗脫方法（１）溶劑洗脫法洗脫曲線洗脫液體積物質濃度（２）置換洗脫法ＡＢ洗脫液體積物質濃度當前5頁，總共69頁。吸附層析（續）（３）前緣洗脫法ＡＡ＋ＢＡ＋Ｂ＋Ｃ洗脫液體積物質濃度當前6頁，總共69頁。３、吸附劑與洗脫劑的選擇（１）吸附劑的選擇極性物易被極性表面吸附；溶解度大的越難吸附；吸附劑分無機和有機吸附；用于酶分離純化的有硅藻土、氧化鋁等，在低pH值、低離子強度下對酶有較強吸附作用，提高難度pH，離子強度即可洗脫。（２）洗脫劑的選擇對于極性組分用極性大的溶液；注意點：洗脫劑不與吸附劑反應、對各組分溶解度大、流動性好，有一定純度。back當前7頁，總共69頁。二、分配層析分配系數指溶質在兩互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩溶劑中濃度比值。通常用一種多孔性固體支持物吸著一種溶劑為固定相。不同溶質有不同分配系數，移動速度不同，從而分離。（１）紙上層析濾紙為支持物，以濾紙纖維結合水為固定相，有機相為流動相，分配系數不同而分離。（２）薄層層析固定相支持物鋪在支持板上成為薄層，有吸附薄層層析，分配薄層層析。back當前8頁，總共69頁。三、離子交換層析利用離子交換上的可解離基團對各種離子的親和力不同，而使不同物質分離。酶是兩性物質，當溶液的pH值大于酶的等電點時，酶分子帶負電荷，可用陰離子交換劑進行層析分離，反之，用陽離子交換劑。用于酶分離純化的常用離子交換劑離子交換樹脂：大孔徑離子交換樹脂。離子交換纖維素：DEAE-纖維素，AE-纖維素，CMC（羧甲基纖維素）離子交換凝膠：DEAE葡聚糖凝膠、DEAE聚丙烯酰胺凝膠等。當前9頁，總共69頁。1、離子交換劑的處理與裝柱；2、上柱；3、冼脫和收集；4、離子交換劑的再生。２、離子交換層析的主要操作過程１、離子交換劑的選擇與處理是含有若干活性基團的不溶性高分子物質；引入不溶性母體的活性基團可以是酸性基團，作為陽離子交換劑；也可是堿性基團，作為陰離子交換劑；平衡常數Ｋ；（１）離子交換劑的選擇；（２）離子交換劑的處理。back當前10頁，總共69頁。四、凝膠層析混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質因分子大小不同而被分離的技術。凝膠層析是60年代初發展起來的一種快速而又簡便的分離技術。目前它已被生物化學、分子生物學、生物工程學及醫藥學等有關領域廣泛應用。從廣義上說凝膠是一類具有三維空間多孔網狀結構的高分子聚合物，如天然物質中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。制成顆粒狀，裝進凝膠層析柱使用。設備簡單，操作方便（不需經過再生處理可反復使用）。不需要有機溶劑，以及對高分子物質有很高的分離效果，適于不同分子量的各種物質。凝膠顆粒當前11頁，總共69頁。McBain(1928)提出；Synge與Tiselins（1950）在解釋凝膠層中的電泳和電滲現象時引用了分子篩的概念。此后發現在柱層析中也有這種現象，于是許多工作者嘗試了一系列適用于生物高分子分離純化用的分子篩。1959年Porath與Flodim將部分水解的葡聚糖凝膠交聯，得到了商品名為交聯葡聚糖（Sephadex)的分子篩。該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質的分離分析中已被廣泛采用。分子篩概念凝膠是分子篩的一種當前12頁，總共69頁。１、凝膠層析的基本原理凝膠顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，加入欲分離的混合物，大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱;分子量最大的物質不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，最后流出柱外。整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質在分離過程中的阻滯減速現象，有人也稱之為阻滯擴散層析、排阻層析等。當前13頁，總共69頁。Kd：分配系數，Kd小的物質先流出。Ve：冼脫體積，表示某一組分從進入導析柱到流出液中出現該組分高峰時，所需的冼脫液的體積。Vo：外體積。層析柱內凝膠顆粒之間空隙的體積Vi：內體積，層析柱內凝膠顆粒內部各微孔體積的總和。表征式討論Kd=1Kd=00<Kd<1Ve=V0,組分足夠大,不進入膠粒微孔,最先流出Ve=V0+Vi,可自由擴散,最后流出Kd小的先流出,Kd大的后流出當前14頁，總共69頁。凝膠層析的基本原理（續）大分子小分子在凝膠內流動速度差異理論：（１）流動分離理論（２）擴散理論組分冼脫體積與相對分子量（Ｍ）關系：ＫavLgM葡聚糖凝膠Ｇ２００葡聚糖凝膠Ｇ１００Ｋav：相對洗脫體積當前15頁，總共69頁。1、葡聚糖凝膠：以葡聚糖為單體聚合而成的高分子聚合物。商品名為Sephader，從G-10到G-200共有8種型號。2、瓊脂糖凝膠：商品名為Sepharose（瑞典）Bib-gelA（美國）Gelarose（丹麥）。3、聚丙烯酰胺凝膠：商品名為Bio-gelP。２、凝膠的選擇與處理當前16頁，總共69頁。加入的酶液量為凝膠床體積的10%左右，不超過30%；冼脫液體積為凝膠床體積的120%左右；冼脫液與干膠溶漲和裝柱平衡用液相同。３、凝膠層析操作過程back當前17頁，總共69頁。五、親和層析利用生物分子對之間所具有的專一而又可逆的親和力使生物分子分離純化?？捎糜谟H和層析生物分子對酶-底物、酶-競爭性抑制劑、酶-輔酶。配基(ligand)作為固定相（成對互配生物分子的任何一方）的一方；母體（載體、擔體）(matrix)不溶性，常用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等。１、親和層析母體和配體配基母體樣品樣品當前18頁，總共69頁。機理圖當前19頁，總共69頁。有兩大類力量，構成分子之間的專一性吸引力。一是兩個分子之間，其構形有如積木般的互補，會因為范德華力的關系，產生專一性吸引力另一則為兩分子之間，因為某些基團間產生了二級鍵，所造成的吸引力。當前20頁，總共69頁。２、親和層析方法（１）共價親和層析（２）水層析（３）金屬離子親和層析（４）免疫親和層析（５）染料親和層析（６）凝集素親和層析back當前21頁，總共69頁。七電泳分離不同的物質，由于其帶電性質及顆粒大小和形狀不同，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不相同，因此可使它們分離。定義帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。原理水平電泳槽泳動度帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度當前22頁，總共69頁。酸堿中F>0F=0H+H+OH-遷移原理圖當前23頁，總共69頁。其它因素（1）電場強度:指每厘米的電壓降；（2）溶液pH值:決定了顆粒分子所帶的凈電荷；（3）溶液離子強度:越高,顆粒泳動越慢；（4）電滲:溶液對固體支持物的相對泳動；此外,緩沖液的黏度、溫度對顆粒的泳動速度也有影響。當前24頁，總共69頁。用途（酶工程領域）酶的純度鑒定;酶分子量測定;酶等電點測定;小批量酶的分離純化.水平電泳儀垂直電泳槽當前25頁，總共69頁。發展形式當前26頁，總共69頁。一、紙電泳二、薄層電泳三、薄膜電泳(link)四、凝膠電泳(link)五、等電聚焦電泳(link)常用的電泳技術毛細管電泳槽

back當前27頁，總共69頁。常用的電泳技術（續）一、紙電泳以濾紙為支持體的電泳技術二、薄層電泳將支持體與緩沖液調成適當厚度的薄層進行電泳三、薄膜電泳以醋酸纖維等高分子物質制成的薄膜為支持體。back當前28頁，總共69頁。四、凝膠電泳垂直管型盤狀電泳；垂直板型電泳。定義以各種具有網狀結構的多孔凝膠作為支撐物（通常是聚丙烯酰胺凝膠）的電泳技術。形狀單面垂直電泳槽當前29頁，總共69頁。

1、聚丙烯酰胺凝膠的制備（操作）電泳染色脫色定性、定量（測量電泳遷移率）制備凝膠go電泳圖譜當前30頁，總共69頁。膠膜放入底座膠膜固定在底座上

加膠放電梳

制膠完成取出

放入電泳槽中

安裝防護罩整套安裝完畢準備電泳

制膠圖示Back當前31頁，總共69頁。按裝置不同分垂直管型盤狀和垂直板型片狀；按凝膠組成系統不同分：2、凝膠電泳分類（1）連續凝膠電泳；（2）不連續凝膠電泳;（3）梯度凝膠電泳;（4）SDS-凝膠電泳;當前32頁，總共69頁。采用相同濃度的單體和交聯劑，相同pH值和濃度的緩沖液制備成連續均勻的凝膠，然后在同一條件下進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙兩烯酰胺在催化劑作用下聚合而成；丙烯酰胺單體濃度對凝膠孔徑有顯著影響1、連續凝膠電泳公式當前33頁，總共69頁。所使用的凝膠由二或三層不同孔徑，不同pH的凝膠層組成;稀釋品在電泳定性中濃縮成層后再進入分離膠分離。提高分率能力;使凈電荷不同或凈電荷相同但分子大小形狀不同的物質分離.2、不連續凝膠電泳樣品膠濃縮膠分離膠當前34頁，總共69頁。凝膠層由上至下分別為：樣品膠、濃縮膠、分離膠樣品膠包含樣品的大孔徑凝膠濃縮膠用于樣品濃縮成導線的大孔徑凝膠，不含樣品，其它與樣品膠一樣分離膠使樣品中各組分電泳分離的孔徑較小的凝膠濃縮膠成層，快離子、慢離子緣故當前35頁，總共69頁。凝膠中的丙烯酰胺濃度由上至下形成由低到高的連續梯度，凝膠內部孔徑由上至下逐漸減小。不同分子量的顆粒電泳后停留在與其大小相對應的位置上。適宜用于測定球蛋白等分子的分子量3、濃度梯度凝膠電泳當前36頁，總共69頁。4、SDS-凝膠電泳在聚丙烯酰胺凝膠制備時，加入1~2%的SDS（十二烷基硫酸鈉）而成。1967，Shapiro等發現。前述的凝膠電泳中，遷移率主要取決于蛋白電荷及分子大小及形狀；SDS-凝膠電泳中，電泳遷移率取決于蛋白分子量大小，而與其分子形狀及其所帶電荷無關，故該方法主要用于測定蛋白質或酶的分子量。當前37頁，總共69頁。兩種不同形式的電泳為什么SDS-凝膠電泳會不受蛋白分子所帶電荷及分子形狀影響呢？SDS陰離子帶負電荷，SDS-蛋白質復合物上結合大量陰離子掩蓋了蛋白質間原來的電荷差別；SDS與蛋白結合后引起蛋白質構象變化，在水溶液中變成長橢圓形，短軸均為18A，長軸與蛋白分子量成正比。當前38頁，總共69頁。故蛋白質電泳遷移率主要取決于其分子量大小,關系可用如下式表示:取對數:故測定某一蛋白質的分子量,只需比較該蛋白質與標準蛋白在SDS-凝膠電泳的遷移率即可.back當前39頁，總共69頁。五、等電聚焦電泳在電泳系統中加入兩性電解質載體（在電場中能夠形成一個由陽極到陰極連續增高的pH梯度），當不同蛋白質等進入該體系中即移動（聚焦）到與其等電點相當的pH位置上，從而使不同等電點的蛋白質得以分離。

IEF原理pH連續增高pI點當前40頁，總共69頁。等電聚焦電泳分離酶蛋白pH大pH小當前41頁，總共69頁。（1）分辯率高（等電點僅差0.01~0.02pH）；（2）防止擴散；（3）不管加樣部位；（4）樣品稀，重現性好；（5）測定等電點準確。等電聚焦電泳顯著特點等電聚焦電泳缺點（1）要求無鹽溶液，會產生沉淀；（2）對在等電點時溶解度低的組分不適。當前42頁，總共69頁。等電聚集電泳的實現1、兩性電解質載體2、穩定pH梯度形成3、支持pH梯度的介質4、聚集電泳的操作當前43頁，總共69頁。1、兩性電解質1966年Vesterberg等人合成載體兩性電解質以后等電聚焦電泳才發展起來;為了獲得穩定的pH梯度,必須要有性能優良的載體兩性電解質,一般是由一系列帶有不同電荷性質(因而有不同pI值)被稱為Ampholyte的聚氨基酸組成；當酶試樣加在凝膠的一端進行電泳時,由于Ampholyte分子量小,泳動快,先在電場中形成一梯度.蛋白質分子受電場作用在這一pH梯度中各自遷移到與其等電點相同的位置,經洗脫可得純化樣品.（1）足夠緩沖力，控制好pH梯度；（2）足夠導電力，且導電系數相同；（3）分子質量小，易分離；（4）與樣品組分不同，不發生反應。當前44頁，總共69頁。2、穩定pH梯度形成陽極槽酸液，陰極槽堿液+-H+OH-ABpIB>pIA當前45頁，總共69頁。3、等電聚焦電泳介質（1）梯度溶液自由溶液在溶解中不添加穩定介質，而用機械方法使pH梯度保持穩定，防止對流；樣品和載體兩性電解質直接與溶液混合；采用臥式電泳槽或豎式電泳管進行。密度梯度采用密度梯度溶液使ph梯度穩定,防止對流和避免已分離組分混合;密度梯度溶液由重溶液和輕溶液在梯度混合器中配制而成,常用的是蔗糖和甘油重溶液、部分載體兩性電解質和樣品液置于混合室；輕液、部分載體兩性電解質和樣品置于貯存室；啟動攪拌器打開閥門，引入等電聚焦柱內。（2）凝膠用聚丙烯酰胺等凝膠穩定pH梯度的等電聚焦電泳制備方法與上述凝膠電泳一樣，但要加載體兩性電解質；凝膠電泳兩極緩沖液相同，而凝膠等電聚焦陽極采用酸溶液，陰極采用堿溶液。當前46頁，總共69頁。4、聚集電泳的操作（1）pH梯度支持介質的制備；（2）電泳（400V～800V）；（3）分離組分檢測或進行下一步的SDS凝膠電泳。當前47頁，總共69頁。等電聚焦電泳的應用與SDS—PAGE組合成雙向電泳；是蛋白質組學中重要的研究技術。10,000V10–25CPeltiercooling12-stripIPGtraysfor

7,11,17,and18cmstripsback當前48頁，總共69頁。八萃取分離利用兩物質在兩相中溶解度不同而使其分離的技術。按兩相組成不同分：一、有機溶劑萃?。╨ink)二、雙水相萃取（link)三、超臨界萃取（link)四、反膠束萃?。╨ink)back當前49頁，總共69頁。有機溶劑萃取利用溶質在水和有機溶液中溶解度不同而分離。應注意變性，在低溫下操作；過程：（1）選擇適宜有機劑；（2）含組分和水溶液與預冷的有機劑混合，靜止分層；（3）將水相與有機相分開；（4）除去有機劑，獲得產物。有機相水相back當前50頁，總共69頁。雙水相萃取兩相為互不相溶的兩水相，組分在兩相中溶解度不同而分離。1、雙水相形成將兩種親水性的聚合物都加在水溶液中,超過某一濃度產生兩相;成相是由于聚合物間不相溶,利用生物物質在兩相中不同的分配實現分離.當前51頁，總共69頁。雙水相萃取(續)關鍵點:制備好雙水相系統;首先選好適宜溶質;其次配制好溶液濃度和比例.雙水相相圖:聚合物Q或鹽/%聚合物P/%TBMT’B’C雙節線系線V1/V2=BM/BT當前52頁，總共69頁。雙水相萃取(續)2、影響物質分配的因素兩相組成；高分子聚合物分子量、濃度、極性；兩相溶液比例；酶分子量、電荷、極性；溫度、pH值等。親合分配雙水相萃取技術：乙二醇抗體人紅細胞兔紅細胞back當前53頁，總共69頁。超臨界萃取利用組分與雜質在超臨界流體SCF中溶解度不同達到分離的一種萃取技術。PSCFGLST超臨界流體：同溫同壓下同物質的液氣相的物理特性不同，當溫度和壓力達到某特定數值時，氣液特性趨于相同，此數值為臨界點，當溫度和壓力超過此點時，兩相變為一相，此態下之流體稱為超臨界流體。當前54頁，總共69頁。超臨界萃取（續）超臨界流體物理特性和傳質特性介于液體和氣體之間：具有和液體同樣的溶解能力，密度比氣體大得多，擴散系數接近氣體，黏度大低于液體的。溶解度大的物質溶解在超臨界流體中，然后升溫或降壓，使其變成氣態而得到所需物質。當前55頁，總共69頁。CO2超臨界萃取工藝(1)萃取.在萃取罐中進行;(2)分離.在分離罐中進行.萃取罐分離罐當前56頁，總共69頁。超臨界萃?。ɡm）根據分離方法不同分離工藝有：1、等壓分離通過溫度變化進行溶質分離；2、等溫分離通過壓力變化使溶質分離；3、吸附分離利用吸附劑將溶質從超臨界CO2中吸附分離。在超臨界流體中加入少量夾帶劑提高分離效果。back當前57頁，總共69頁。反膠束萃取反膠束(reversedmicelle)，表面活性劑分散于連續有機相中形成的納米尺度的聚集體，是透明、熱力學穩定的系統。利用反膠束將酶蛋白從混合液中萃取出來的純化技術。1977年Luisi等首先發現胰凝乳蛋白酶可以溶解于含雙親物質(表面活性劑)的有機溶劑中,超離心數據顯示有機相中有反膠束的存在,同時,光譜分析(紫外2可見光譜、熒光光譜、旋光光譜)表明這一過程未引起酶的變性;1979年Luisi等考察了蛋白質溶液的pH值、蛋白質和雙親物質的濃度對蛋白質萃取率的影響及蛋白質在反膠束溶液中的光譜特性;1979年Menger和Yamada對反膠束溶液中酶的性質進行了研究。當前58頁，總共69頁。反膠束萃?。ɡm）1、膠束與反膠束的形成表面活性劑溶于水在水中聚集一起形成（正膠束）;極性基團在外,非極性基團在內,溶解非極性物質;表面活性劑(雙親物質)在非極性有機溶劑中自發聚集體,又稱為反膠團、逆膠束(inversemicelle),極核具溶解極性物能力;反膠束作為液-液萃取法更具選擇性;過程:酶從水相萃取到反膠束相;

酶蛋白從反膠束轉移至第二水相.當前59頁，總共69頁。反膠束萃?。ɡm）2、表面活性劑由極性基團和非極性基團組成，分陽離子、陰離子和非離子型；如AOT（丁二酸乙已基酯磺酸鈉）為陰離子型;反膠束萃取中，通常與某些有機劑一起使用。3、注意因素（1）水相pH,決定了蛋白表面帶電基團離子化狀態；（2）離子強度，決定了帶電表面所賦予的靜電屏蔽程度。降低蛋白質與反膠束帶電界面的靜電作用;降低了表面活性劑頭部基團間靜電斥力,導致反膠束顆粒變小.back當前60頁，總共69頁。九酶的結晶定義溶質以晶體形式從溶液中析出的過程。結晶是蛋白酶分離純化的一種手段，可獲得較高純度的酶。結晶的基本原理使母液中酶的溶解度慢慢降低，使處于稍飽和狀態使酶結晶出來。當前61頁，總共69頁。（1）酶液中酶的純度