第一節雞胚接一、雞胚的結構雞胚是正在發育的活的機體組織分化程度低細胞代謝旺盛適于許多人類和動物病毒的生長增殖是常用的病毒分離培養方法之（衣原體立克次體的分離亦用雞胚）。目前，雞胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、皰疹病毒及腦炎病毒，尤其在禽類病毒的研究上應用較多。可用于病毒的分離、鑒定，抗原和疫苗制備以及病毒性質的研究等雖然隨著組織培養技術的不斷發展不少病毒已不再用雞胚來分離培養但對某些病毒來說雞胚仍是一種不可缺少的培養手段。雞胚培養的優點是，來源充足，價格低廉，操作簡單，無需特殊設備或條件易感病毒譜較廣對接種的病毒不產生抗體等當然胚培養也有其缺點，即除痘斑和雞胚死亡是特異性感染指征外需用第二試驗系統來測定病毒存在與否；非SPF雞胚，亦可能含有對某些家禽病毒的母源抗體，甚至還可能帶有雞白痢沙門氏菌、霉形體、雞白血病等病毒。因此，用雞胚分離培養病毒時，必須考慮這些問題原則上應使用非免疫蛋來孵雞胚最好用SPF雞胚。一般說來孵育至8-14天的雞胚最有利于病毒的生長因為此階段雞胚發育日趨完善各種臟器均已形成已能經受接種物的適當刺激同時胚胎細胞幼嫩，骨胳不健全，還未長出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同時也有利于收獲高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛漸生，已不便感染病毒，特別是已不利于收獲病毒材料。在操作雞胚時）一定要注意到這一點。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黃陷入胚胎腹部，另一部分則仍留在體外，胚胎已發育成小雞，破殼而出。雞胚的基本結構如圖，從圖中可以看出，雞胚的最外層為石灰質的卵殼，上有氣孔供氣體交換，卵殼之下為殼膜很易與卵殼分離其功能是使氣體分子與胚胎內的液體分子在內外進行交換因此在孵育時需要有一定的濕度和空氣如果濕度太低雞胚就容易脫水、引起雞胚死亡。氣流不通，雞胚缺氧，同樣會造成雞胚死亡。雞胚的鈍頭（俗稱“大頭”），是氣室，其功能是呼吸和調節胚內壓力。殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，其外層為絨毛膜，系外胚層形成，內層為尿囊膜，系內胚層形成兩膜所夾為中胚層由于胚胎的肺發育不完善此時絨毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用氣體的交換是在絨毛尿囊膜的血管內通過卵殼進行的尿囊腔是胚胎的排泄器官含的尿囊液初為透明液體極類似于生理鹽水溶液，以后則尿酸鹽含量增高。尿囊液量在11-13日齡時最高，平均達6毫升左右。羊膜是胚胎的最內層包被，系外胚層和中胚層形成，羊膜腔內含羊水，胚胎浸于其中羊水在起初是單純的生理鹽水溶液以后蛋白質含量增加羊水量在8-15日齡時最高平均約為1毫升左右附著于胚胎上的是卵黃囊其膜系由內胚層和中胚層形成內包卵黃胚胎發育的養料卵的尖（俗稱“小頭”）是卵白，是胚胎發育晚期的養料。二、雞胚培養實驗用器械不雞胚培養技術簡便，但一些最基本的設備仍需具備，它們包括：孵化箱、檢卵器、卵架、打孔器、鑷子、酒精燈、無菌眼科鑷子和剪刀、吸頭、洗耳球、注射器、適用的針頭、無菌試營、平皿、三角瓶、燒杯、消毒膠布、石蠟和滅菌生理鹽水等。下面就一些最基本的設備作一簡單介紹：孵化箱是給受精卵提供發育條件的設備要求恒溫恒濕市售專用孵化箱可自動進行氣體交換和翻蛋實驗室中常用普通恒溫培養箱或恒溫室代替要注意保持室內濕度和人工翻蛋。檢卵器有市售專用檢卵器，在暗室中操作。也可根據條件向行設計，用木板制成一大小為35×15厘米的木盒，上半層為一暗室，上方開一小孔，以便于用眼檢視雞胚，兩側開大孔以供雙手伸入小暗室轉動雞胚蛋和進行標記。木盒中間有一隔板，其中間部位開一卵形圓孔，木盒下層安裝有100瓦燈泡，待檢胚蛋置于卵形孔上。開燈檢查，不必在暗室中進行。打孔器可用剪刀代替.卵架孵育用盛放雞胚蛋的卵盤有市售專用者，實驗操作中所用卵架可用木板制成小方盒，上面開一卵形孔。三、雞胚的實驗室孵育選擇實驗室用雞卵，最好用白色薄殼雞蛋，其易于觀察胚胎的生活情況。實驗用卵一般不宜保存過長時間，通常保存期不應超過10天，5天以內最好。而且不宜在高溫下保存，通常保存于4~20℃，以10℃條件下最好。適宜的孵育溫度為38~39℃，相對濕度為45~60％，并注意空氣流通。孵育3天后每天應翻卵1~2次，以保證氣體交換均勻，發育齊全，從而避免半邊發育現象的出現孵后第四天用檢卵器對雞卵進行檢視檢出未受精卵和死亡的雞胚經四天孵育后未受精卵不見有雞胚跡象僅見模糊的卵黃暗影受精卵則可見清晰的血管小團，其中有雞胚跡象，較大的雞胚可見到胚胎主動運動;瀕死或死亡的雞胚則見到胚胎運動呆滯或不運動血管昏暗折斷或漂落這種雞胚應剔出不用。四、雞胚的接種1.絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上形成痘斑和病斑此外其它用于絨毛尿囊腔接種的病毒也可使用而且收毒量更高，缺點是操作不易成功。選取10-13日齡的雞胚照檢后將氣室及胚胎位劃出并在胚位附近無大血管處劃一記號用蛋鉆在卵殼上磨一裂（或用電烙器在卵殼上烙出一個直徑為2-3mm的烤焦圈心將蛋殼去掉，注意切勿損傷殼膜；在氣室中央也鉆一個小口用針尖挑破殼膜切勿損傷其下的絨毛尿囊膜滴加滴無菌生理鹽水于刺破處，用吸耳球緊貼氣室中央小口，造成負壓，即可見生理鹽水下沉，絨毛尿囊膜凹下，和殼膜分開，造成人工氣室。滴加接種物于絨毛尿囊膜上，臘封口，封口部位朝上，不要翻動，℃培養。2.囊腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分離和增殖，馬腦炎病毒也常用、IBD、IBDV也可。選取9-11日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，在氣室邊緣上打一小口，避開大血管處，注射器沿小口插入1-1.5cm注入接種物0.1-0.2ml，臘封口。3.卵黃囊接種主要用于蟲媒批膜病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體的分離和增殖。選取6-8日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出；垂直放置在卵座上，在氣室中央鉆一個小口，注射器沿小口插入3cm，注入接種物0.1-0.5ml，臘封口。4.羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖作技術比較困難。開窗法從氣室處去蛋殼開窗從窗口用小鑷子剝開蛋膜一手用平頭鑷子夾住羊膜腔向上提，另一手注射0.05-0.1ml種物于腔內，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受傷而死，而且易污染。盲刺法：將雞胚放在燈光向上照射的蛋座上，使蛋轉動使胚胎面向術者。在氣室頂部到邊緣的一半處打一孔40mm的針頭垂直插入深30mm以上。如已刺如羊膜腔，能使針頭撥動胚即可注入接種物，如針頭左右移動時胚胎隨著移動則針頭已刺入胚胎這時應將針頭稍提起后再注射蠟封口。五.雞胚材料的收獲原則上接種什么部位，收獲什么部位。絨毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接種部位及四周，揭去封閉處的卵殼。用滅菌鑷子擴大開口處輕夾起絨毛尿囊膜毒剪刀剪下接種面及周圍的膜，置于滅菌生理鹽水的平皿中。尿囊腔接種：收獲前將雞胚4℃冰箱中6h或過夜將雞胚凍死而使血液凝固，以免收獲時流血。用碘酊、酒精消毒氣室部位卵殼，以無菌鑷子擊破氣室端卵殼，沿氣室周圍剪去卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，用鑷子輕輕壓住胚胎，以無菌吸管或注射器吸取尿囊液于滅菌試管內收集的液體應清亮渾濁則表明有細菌污染呈血紅色說明血管破裂黃色液體可能卵黃囊被刺破應做無菌檢驗。羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。后用注射器插入羊膜腔內收集，約可收到1ml液體，無菌檢測。卵黃囊：先首先收取尿囊液和羊膜腔液，后用吸管吸卵黃液。將整個內容物傾入無菌平皿中，剪取卵黃膜保存。第四節細胞培養常用設準備室設備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品儲品規（放置消毒過的物品裝臺。配液室設備：扭力天平和電子天（稱量藥品（測量培養用液值攪拌（配置溶液室攪拌溶液培養室設備：液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞凈工作臺、倒置顯微鏡、孵箱（孵育培養物水浴鍋氧消毒殺菌機℃冰放置serum和養用液無菌操無

菌室的菌：定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。CO2孵箱（培養箱）滅菌：先3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射實驗前滅菌打開紫外燈三氧殺菌機空氣凈化器系統各分鐘實驗后滅菌：用75％酒精（‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。實驗人的無菌準備肥皂洗手。可減少手上的微生物。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋。但是在潔凈工作臺上時就無需上述防護。如果你有長頭發，則應把它系在腦后。不要說話或少說話。如果感冒，則最好不要做組織培養工作。用75％酒精棉球擦凈雙手。無菌操作的演示：凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要75％酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。器皿使用前必須過火滅菌繼續使用的器（如瓶蓋管放在高處使用時仍要過火。各種操作要靠近酒精燈動作要輕確不能亂碰吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管止交叉污染。器械的洗和消毒一、新的玻璃器皿的洗消：自來水刷洗，除去灰塵。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15，最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。烘干裝干凈后先烘干然后用牛皮油光紙裝。高壓消毒包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子打開開關和安全閥當蒸氣成直線上升時閉安全閥指針指向磅時持20-30分鐘。高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶洗滌劑器皿要用清水刷洗干凈后烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗蒸餾水沖洗次。烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣當蒸氣成直線冒出分鐘后關閉安全閥氣壓表指數隨之上升當指針指向15磅時調節電開關維持20-30分鐘即可璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內磅高分鐘消毒烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是先用洗滌劑洗刷干凈再分別用自來水和蒸餾水沖干凈用烤箱烘干后根據不同品質進行如下的處理程序：針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分,在包裝之前要裝好濾膜兩張裝濾膜時注意光面朝上(凹上)后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘消毒再烘干備用注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分用過的膠塞只要用沸水處理分鐘自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈干后裝入鋁盒內高壓消毒干備用。膠帽，離心管帽烘干后只能2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30鐘，再用自來水，蒸餾水蒸水洗凈干后裝入鋁盒內高壓消毒烘干備用。膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘后紫外照射后使用即可。塑料培養瓶，培養板，凍存管：其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70％酒精浸泡消毒塑料培養皿打開蓋子放在超凈臺臺面上接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品毒后需要用2周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆可在紙包裝后用密寫墨水作好標記其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水在包裝紙上作一記號平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制化鉆(6H2o)2g％鹽酸10m1餾水88m1注意事項：嚴格執行高壓鍋的操作規程高壓消毒時先檢查鍋內是否有蒸餾水以防高壓時燒干水不能過多因為其將使空氣流暢受阻會降低高壓消毒效果檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。安裝濾膜時注意光面朝上注意濾膜光滑一面是正面要朝上否則起不到過濾的作用。注意人體的防護和器皿的完全浸泡A.泡酸時要戴耐酸手套防止酸液濺起傷害人體B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面會腐蝕地面C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。細胞培用液的配制消毒器材與試劑：干粉型培養基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉.純凈水系統、電子天平、計、磁力攪拌器。具體步驟：一.水的制備：細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如Hanks，D-Hanks液的配制)：溶解定容：將藥品（8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的溶液。移入溶液瓶內待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。三.胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣胰酶分散細胞的活性還與其濃度溫度和作用時間有關，在8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+和血清蛋白質克降低胰酶的活性所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+Mg2+的BSS，如：D-Hanks。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸（若用雙蒸水需要調到7.2左右或（D-hanks液中。攪拌混勻，置于4℃內過夜。用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器0.22微米微孔濾膜濾除菌后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒所用純凈水（雙蒸水）需要磅高壓20分鐘滅菌。具體操作均在超凈臺內完成青霉素是萬單位/瓶用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。使用時溶入培養液中青鏈霉素的濃度最終100位/ml單位＝微克？五.RPMI1640的制備與消毒：溶解調PH值定容先將培養基粉劑加入培養液體積的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3(沖洗液一并加入培養基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,青鏈霉素的濃度最終各為100單/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。最后定容至1000ml搖勻。安裝蔡式濾器安裝時先裝好支架按規定放好濾膜用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。抽濾配制好的培養液通常用濾器過濾除菌通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。分裝過濾好的培養液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。使用前要向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶時兩周有效六．血清的滅火：細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在℃水浴中滅火30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。七.HEPES溶液：HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸N’-a-hydroxythylpiperazine-Nethanesulfanicacid細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為，一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：準確稱取HEPTS加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。注意為現在市售為約10g包裝的小瓶以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然20m4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中濾除菌后可完（20ml入1L培養液中者每培養液中加入2ml即可。八.谷氨酰胺：合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺其作用非常重要細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2以上時應重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養液中谷氨酰胺的含量為1。可以配制200mmol/L氨酰胺液貯存，用時加入培養液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶℃保存，使用時可向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液。九.肝素溶液的配制：含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中最終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉，包裝為約為克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為-℃。使用時，100ml培養液中加入1ml（精確可加入0.9ml即可。十.Ⅰ型膠原酶：0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。十一.明膠溶液：因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作的問題是如何無菌準確稱量0.1成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入小瓶中4℃保存。其他培養用液的配制：20ug/ml內皮生長因子，注意事項：配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。安裝蔡式濾器時通常使用孔徑米和米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方且要特別注意濾膜光面朝上。配制RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值最終為7.2，可在配制時調至7.4。細胞傳培養（消化）具體操作：一.傳代前準備：預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。點燃酒精燈：注意火焰不能太小。準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火8分鐘再次消毒。取出預熱好的培養用液取出已經預熱好的培養用液用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。打開瓶口各瓶口一一打開時要在酒精燈上燒口消毒。二.胰蛋白酶消化；加入消化液：小心吸出舊培養液，PBS清洗（沖洗入適量消化液（胰蛋白酶液消化液的量以蓋住細胞最好最佳消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞倒置顯微鏡下觀察消化細胞若胞質回縮細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。三.吹打分散細胞：吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入離心管中。平衡離心衡后將離心管放入臺式離心機中轉/分鐘離心分鐘。棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。四.分裝稀釋細胞：分裝將細胞懸液吸出分裝至個培養瓶中加入適量培養基旋緊瓶蓋。顯微鏡下觀察細胞倒置顯微鏡下觀察細胞量必要是計數注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于。最后要做好標記。五.繼續培養：用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附瓶壁上長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。傳代細胞培養注意事項：嚴格的無菌操作適度消化消化的時間受消化液的種類配制時間加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA，NaCl8.00g，KCl，KH2PO4，葡萄糖2.00g％酚紅4ml，加入蒸餾水定容1000ml磅20min高壓滅菌，使用時調節PH值到7.4。注意不能被血清中和，使用后培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁.細胞的蘇細復的則快融：須將凍存在-℃液氮中的細胞速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶對細胞造成損害。具體操作一.實驗前準備：將水浴鍋預熱至℃用75％酒精擦拭紫外線照射的超凈工作臺臺面。在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。二．取出凍存管：根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。從液氮罐中取出細胞盒取出所需的細胞同時核對管外的編號。三．迅速解凍：迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。四.平衡離心：用架盤天平平衡后入離心機中3000r/min離心3min五.制備細胞懸液：吸棄上清液。向離心管內加入培養液打成細胞懸液。六.細胞計數：細胞濃度以為宜。七.培養細胞將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內小時（或者24-48小時）后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。初學者易犯錯誤：1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。一次復蘇細胞過多記更換吸頭和吸管致細胞交叉污染。細胞計實驗原理當待測細胞懸液中細胞均勻分布時通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。具體操作：一.準備工作：取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。二.細胞懸液制備：細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化PBS液洗滌后加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液成待測細胞懸液。三.細胞計數：蓋好蓋玻片取一套血球計數板將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入要保證蓋片下充滿懸液注意蓋片下不要有氣泡也不能讓懸液流入旁邊槽中。統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板當看到鏡中出現計數方格后數出四角的四個大（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數）/ml＝（四個大格子細胞數4)×2×104說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為細胞計數要點：進行細胞計數時要求懸液中細胞數目不低于個/ml如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；要求細胞懸液中的細胞分散良好則影響計數準確性。取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；數細胞的原則是只數完整的細胞若細胞聚集成團時只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。操作時注意蓋片下不能有氣泡也不能讓懸液流入旁邊槽中否則要重新計數。五.初學者易犯的錯誤：計數前未將待測懸液吹打均勻。滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。滴入懸液時的量太多使細胞懸液流入旁邊的槽中。六.本實驗特殊試劑的配制：4％臺盼藍母液稱取4克臺盼藍加入少量蒸餾水研磨加雙蒸水至毫升，用濾紙過濾，4℃保存。使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。細胞的存先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。接著置于-20℃冰箱，約。置于-80超低溫冰箱中放置過夜。置于液氮罐中長期保存。5同時做好凍存記錄自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。注意事項：使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。不宜將凍存細胞放置在0℃～-60這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。雞胚原細胞培養（胚成纖細胞的制作取9-11日齡的雞胚，將胚蛋氣管端向上，用碘酊、酒精消毒氣室，以鑷子擊碎卵殼并棄之沿氣室周圍剪去卵殼撕去殼膜和絨毛尿囊膜取出胚胎于滅菌平皿中。剪去頭部、翅爪及內臟，以Hanks沖洗體表數次，移入滅菌小瓶中，在用剪刀剪成小塊，使其成為約大小的碎塊，以Hanks液沖洗體表數次；自水浴中取出預熱的0.25%胰酶適量個雞胚約需5ml胰酶水浴消化15-20分鐘其間每5分鐘輕搖一次至液體變得混而稍稠此時再輕搖可見組織塊懸浮在液體內而不易下降時則終止消化吸棄胰酶再以Hanks液沖洗三次經大口吸管吹打分散少許營養（DMEM培養液犢牛血清鏈霉素500U/ml，PH7.2-7.4輕輕懸浮經8層紗布過率收集的細胞經計數調整細胞濃度至106個/ml，混勻，分裝于細胞培養瓶中，于培養箱中37℃培養24h-48h。長成單層的細胞換液，加入維持液：DMEM培養液、犢牛血清、青鏈霉素，PH7.2第三章電顯微鏡術觀察病毒學時）教學目：熟悉掌握毒的電顯微鏡觀察術。教學重：樣品的基制備技。教學難：病毒電鏡品的制。基本教內容：第一節電顯微鏡術概述一.電子顯微鏡的發展光學顯微鏡發明后即成為醫學生物學和其他學科不可缺少的研究工具可以看到許多微生物和構成生物的基本單元—細胞但隨著人類認識的逐步深化對觀察微小物體的要求越來越高。大型電子顯微鏡20~100萬倍0.144~0.34nm中型電子顯微鏡5~20萬倍0.34~1.0nm小型電子顯微鏡5萬倍以下1.0nm以上二.電子顯微鏡的分類1.透射電子顯微鏡2掃描電子顯微鏡其主要特點是景深大，圖像富有立體感，制樣簡便，在觀察形貌的同時，還可以利用樣品發出的其他信息在微小區域上作成份分析和晶體結構分析。第二節電樣品的本制備技術一.超薄切片超薄切片法是研究病毒特征以及病毒與細胞之間相互作用的有效手段。將組織或細胞樣品，加入PH7.2二醛進行前固定，4℃24小時；用PH7.2PBS沖洗三次，每次分鐘；用2%四氧化餓在通風櫥內進行后固定小時；用PH7.2PBS沖洗三次，每次分鐘；分別用濃度為50%、70%、80%、90%的乙醇進行脫水，每次分鐘，100%乙醇中脫水三次，其它濃度中各一次；用1100%乙醇和丙酮丙酮各置換一次次分鐘；用純丙酮和環氧樹脂包埋劑按濃度梯度對樣品進行浸透；將樣品置于恒溫培養箱中聚合；用ULTRACDTE型超薄切片機進行切片，將切片用載網撈起，放入培養皿中；用醛酸雙氧鉑檸檬酸鉛分別對樣品染色分鐘雙蒸水沖洗干燥后放入培養皿中待檢。二.負染色負染色也叫陰性反差染色種染色法是用重金屬鹽類溶液與樣品混合而使樣品呈現出良好的反差經這種方法染色的生物樣品在電鏡下是暗背景下的亮物體像，與通常的染色性質相反，所以稱之為負染色。負染色的主要特點是反差強分辨力高可以看到病毒的亞單位結構在較段時間內可得出結果。負染色使用的染液有磷鎢酸磷鉬酸醋酸鈾等最常用的是：PH6.8的2%磷鎢酸溶液適用于多種病毒。被觀察的材料最好是比較純凈的病毒懸液。三.掃描電鏡樣品的制備掃描電鏡具有分辨率高和景深長等特,因此圖像層次豐富,立體感強,能夠顯示細胞和組織的三維結構形貌,廣泛應用于生物樣品表面及其斷面微結構的觀察.四.免疫電鏡免疫電鏡技術是把免疫化學技術與電鏡技術有機地結合起,之兼有兩方面的特性,所以是研究抗-體相互作用的一種方法.抗原-抗體之間的相互作用是免疫化學反應的基礎,它具高度的特異性,結合電鏡的高分辨能力和放大本領,可在超微結構和分子水平研究各種組織和細胞內的免疫反應并能精確定性定位和半定量，使形態與機能緊密結合。第四章病和病毒分的提純（學時教學目：熟悉掌握毒和病成分的提純教學重：病毒提純具體操方法。教學難：超速離心提純病的原理和方。基本教內容：第一節病的提純病毒的提純，就是應用各種物理、化學方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細胞組分等非病毒雜質取出高純度濃度的病毒樣品。病毒的純度只是一個相對的概念常以下列幾點作為判定依據。物理均一性病毒滴度與蛋白質含量的比例免疫學反應結晶形成一.沉淀法1.中性鹽沉淀法病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀持其感染性。2.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇（）為水溶性非離子型聚合物，具有各種不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量為2000~6000的PEG。將配置成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其達到所需濃度，通常4℃攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。有機溶劑沉淀法等電點沉淀法二.層析法葡聚糖柱層析法凝膠層析法離子交換纖維素柱層析法親和層析法三.紅細胞吸附法所謂病毒的紅細胞凝集反應是指病毒被紅細胞表面粘蛋白吸附的現象。四.電泳法五.超速離心法病毒經初步濃縮之后進一步純化常采用超速離心法。1.差速離心法差速離心法適用于從組織培養液、雞胚尿囊液或經過紅細胞吸-釋放的病毒懸液中提純病毒。以差速離心法分離提純病毒時，經常以低速2000~3000rpm分鐘）及中速（10000rpm，20-30分鐘）去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其他較大的雜質。然后，選擇60分鐘內能夠沉淀80%上的病毒粒子的較高速度，離心1-2小時，使病毒沉淀。對中、大型病毒如流行性感冒病毒，在經紅細胞吸附—稀釋后，于離60分鐘，即可達到目的。小型病毒如脊髓灰質炎、披膜病毒，則需以35000-45000rpm離心小時。2.速度區帶離心法是根據被分離物質在強大離心力中沉降速度不同而進行的分離方法質可以為均一密度也可以梯度密度當被分離的物質沉降到與介質密度相等的區域是就不再沉降不同分子形成不同的區帶為速度區帶常用的介質為蔗糖甘油、聚蔗糖。常用的梯度范圍從5%-20%：10%-60%3.平衡密度梯度離心法大多數病毒的浮密度在1.10-1.40范圍內制備密度范圍為的懸浮介質，便可滿足大多數病毒密度梯度離心的需要。六.超濾法利用超濾膜將水鹽及小分子濾過將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮的一種方法。第二節病蛋白亞位的分離第三節病核酸的提第五章病的常規驗室診斷（學時教學目：熟悉掌握毒的常實驗室診斷法。教學重：病毒的血學診斷教學難：病毒感染的滴定中和實驗。基本教內容：第一節病的初步定1.病毒增殖的判定病毒在實驗動物體雞胚和組織培養細胞內增殖顯然都會影響機體和細胞和生命活動，并經常通過一定的形態學和病理學變化表現出來。a.細胞病變（CPE）細胞病變是病毒在細胞內增殖內增殖及其對細胞產生損害的最明顯的表現括胞漿的顆粒變性、胞核的變形和破裂。細胞病變經常具有病“種特性以作為病毒鑒定的依據之一。b.細胞代謝的測定PH值下降抗原的測定病毒間的干擾現象2.病毒感染力的滴定實驗動物測定LD50（半數致死量）雞胚上的EID50（半數雞胚感染量）組織細胞上測定TCID50（半數細胞培養物感染量）1.Reed-Muench法病毒液稀釋度

細胞管觀察結果累計細胞管樹出現CPE不出現出現CPE不出現CPE胞管總數管管管管

出現CPE細胞管所占的%10-110-2

8027027100（27/27）8019019100（19/19）10-3711111291.6（11/12）10-435461040（4/10）10-517113140.7（1/14）10-6

08021210（0/21）出現細胞病以及血凝素等的細胞管數分別列于表的第2和第3列，它們的累計數分別列于第4和第5列（根據箭頭所示方向6列為細胞管總數第7列為出現細胞病變的細胞管數占細胞管總數的百分率可見該病毒株的TCID在10（91.6%）和10（40%）之間，其確切稀釋倍數可按下列公50式計算：=（高于的百分數41.6（高于50%的百分數（低于50%的百分數）51.6

0.8將由上式獲得的0.8加在高于死亡的稀釋度的對數（3）上，因此該病毒的TCID應是0.1ml10-3.8稀釋的病毒液。查反對數，得，即該病毒50倍稀釋液0.1ml等于1個TCID。503.病毒理化特性的測定a.病毒核酸型鑒定是DNA病毒，還是RNA病毒？b.脂溶性敏感性試驗乙醚敏感性試驗氯仿敏感性試驗耐酸性試驗胰蛋白酶敏感試驗耐熱性試驗病毒粒子大小測定第二節病的免疫血清學檢測1.中和試驗中和抗體動物在受到病毒感染后體內產生抗體如果該抗體能與相應的病毒粒子特意性地結合后者喪失感染力種抗體稱為中和抗體。中和抗體一般是針對病毒的蛋白衣殼或囊膜抗原的不是針對病毒粒子的內部成分應用已知的病毒或病毒抗原可以測知患病動物體內中和抗體的存在及其效價。應用已知的抗病毒血清或中和性單克隆抗體也可以進行病毒的鑒定因此中和試驗也常用于新分離病毒株的鑒定。中和試驗具有高度的敏感性和免疫特意性，常可用以偵察其他血清學反應難以測出的病毒株之間的抗原差異。進行中和試驗，首先要選擇試驗宿主。（1）終點法中和試驗有固定病毒—稀釋血清法和固定血清—稀釋病毒法a.固定病毒—稀釋血清法：將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般100個TCID50、EID50）混合，置適當的條件下感作一定時間以后，再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或實驗動物，測定被檢血清阻止組織培養細胞胚或實驗動物發生病毒感染的能力及其效價能保護組織培養細胞、雞胚或實驗動物不發生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數，作為該血清的50%中和效價。病毒稀釋---血清---感作—對照—接種—觀察和解釋—b.蝕斑減數試驗蝕斑用稀釋的病毒液感染單層細胞由于其致細胞病變作用而在單層細胞上形成蝕斑。從理論上講，一個病毒粒子形成一個蝕斑，因此根據蝕斑的大小、形狀和色澤等性狀選擇不同的代表進行移植傳代就有可能獲得若干不同的純系毒株。但在實際上，一個蝕斑往往由幾十個乃至幾百個病毒粒子形成。因此，由一個蝕斑分離獲得的毒株常是許多個病毒的后代，需要進行反復多次的蝕斑分離，才有可能獲得來源一個病毒粒子的“純系”病毒。病毒+正常動物血清蝕斑數（平均）待檢血清稀釋+病毒中和后蝕斑數（平均）能使病毒蝕斑減少50%的血清稀釋度。c.交叉保護試驗2.血凝和血凝抑制實驗病毒+紅細胞→凝集血凝的條件和特點:18～22℃最適宜操作方法：取血凝板,做好標記.按表1順序和劑量加入各種材料表紅細胞集試驗操作程序

單位ul病毒稀1:2

1

1:2

2

1:2

3

1:2

4

1:2

5

1:2

6

1:2

7

1:2

8

1:2

9

1:2

10

1:2

11

對釋度

照生理鹽252525252525252525252525水病液

毒2525252525252525252525棄1%紅細252525252525252525252525胞搖勻,放室溫，觀察結果。結果判定操作方法:取血凝板作好標記按表4的順序和劑量加入各種材料：表4紅細胞集抑制驗的操作順

單位：ul血清稀釋度1:2

1

1:2

2

1:2

3

1:2

4

1:2

5

1:2

6

1:2

7

1:2

8

1:2

9

血清病毒血球生理鹽水252525252525252525

對照對照對照252550抗血清25

25

25

25

25

25

25

25

25

25------棄病毒

液25

25

25

25

25

25

25

25

25

---25

---1%紅細胞25

25

25

25

25

25

25

25

25

2525

253.搖勻，置室溫，觀察結果。4.結果判斷3.瓊脂擴散實驗應用病毒瓊擴標準陽性血清通過瓊脂免疫擴散試驗對本試驗所分離到的病毒進行鑒定，具體操作過程如下：用0.85%NaCL液配制含1%瓊脂糖的凝膠溶液，加熱待瓊脂糖完全溶解后注入平皿中，凝固后置于4℃冰箱2h后，取出打孔，剔除孔內的瓊脂用酒精燈加熱封底中央孔為病毒瓊擴標準陽性血清周圍留一孔為陽性對照，其余孔為經初步提純的病毒懸液。4.免疫熒光實驗將-70℃保存的一份感染臟器冰凍切片成，置于載玻片上，用丙酮固定，室溫5分鐘，用pH7.2的PBS洗滌3次，每次分鐘，晾干后加入相應的陽性血清（1:16稀釋）37℃作用45分。PBS沖洗3次，每次5分鐘，晾干后加入含0.01%伊文思藍的熒光標記的兔抗雞（，37℃作用45分鐘，PBS沖洗3次每次5分鐘晾干后用緩沖甘油封片用熒光顯微鏡觀察和拍照。同時設立陽性對照、陰性對照、熒光抗體對照第六章病的分子物學診斷（學時教學目：熟悉掌握毒的分生物學診斷法。教學重：病毒核酸提取和技術。教學難：PCR技術。基本教內容：概述近年來隨著分子生物學技術的飛速發展尤其是分子遺傳學的進步大大提高了病毒病的診斷水平毒病的實驗室診斷技術已從常規的病毒分離鑒定以及抗原和抗體的免疫學檢測入可對病毒基因序列和結構直接進行測定的分子生物學水平。病毒病的分子生物學診斷，包括對病毒核酸（或RNA和蛋白等的測定關鍵在于測定這些分子的特異性序列或結構病毒基因往往含有特異序列可以用核酸雜交的方法予以檢出而這段序列的存在則說明了相應病毒的存在。雖然病毒是嚴格細胞內寄生的最小最簡單的生命形式但也具有與宿主細胞不同的獨特的核酸序列和基因結構用的分子生物學診斷技術包括基因組電泳分析酶切圖譜分析核苷酸指紋圖酸雜交合酶鏈式反（PCR）等。其中核酸雜交PCR技術又以其特異、快速、敏感、適于早期和大量樣品的檢測等優點，成為當今病毒病診斷中最具有應用價值的方法DNA雜交的靈敏度已經提高到0.05pg/ul，也就是說，只要有1000個DNA拷貝，就可能被檢測出來。使用PCR甚至可以檢測出一個拷貝的DNA子。第一節病毒核酸的取技術懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀洗滌細胞3次每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀使其徹底分散。估計細胞沉淀的體積倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml充分混勻后置于37℃溫育30鐘蛋白酶K以貯存的形式保存存液為20μg/ml白酶K水溶液。二提取步驟用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質。用吊桶式轉頭于室溫以離心10分鐘使水相與有機相分相，將水相吸至一個新的離心管內2.5倍體積用冰預次序的乙醇分混勻，于0℃放置1小時。30℃以5000g離心分鐘沉淀RNA上清含乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡，隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。4）每直徑為90mm的培養每107細胞加200μl50mmol/LTris.Cl(pH7.8)1mmol/LEDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。5分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加和二硫蘇糖（DTT后分別按1000單位/或10mmol/L的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。6加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2勻37℃溫育60分鐘。7）分別按10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTASDS。用等體積酚：氯仿抽提1次。于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相，將水相吸至另一個離心管內加3mol/L酸（pH5.2至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇分混勻浴放置小時。用微量離心機于4℃以12000g離心5分鐘沉淀RNA。吸出所有的乙醇將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘讓最后殘存的痕量乙醇揮發干凈。用200μlTE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70℃貯存備用。回收DNA時須取出小份貯存液入3mol/L乙酸）至終濃度為充分混勻，用微量離心機于4℃以000g離心5分鐘即可。三注意事項1．測定最終所得溶液OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液[步驟13）]離心沉淀RNA，以400水重溶，測定OD260值，的RNA溶液每毫升約含40μgRNA。如果需要，可用oligo(dT)－纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行的純化。某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA染的細胞中制備RNA時須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題，反轉錄過程中法染的模板片段可能會與雜交而充當引物而導致物mRNA5'末端定位的錯誤或產生截短的cDNA克隆。步驟12后加3mol/L乙酸（pH5.2自動微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。用微量離心機于室溫以12000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。棄上清液μlpH7.6沉淀20μl3mol/L乙酸分混勻，加入μl用冰預冷的乙醇。混勻溶液，在冰上驟冷分鐘。用微量離心機于4℃以12000g離主10鐘，以回收。小心吸出上清。d）棄上清液，用300μlTE（pH7.6）溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存備用。回收RNA時，只需取出1小份貯存液，加乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離機于4℃以12000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚用0.01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]將RNA終溶液抽提數次即可。4.對大多數細胞株來說一個直徑90mm培養甲中培養的RNA收率為μg第二節病毒的PCR檢測技術PCR技術概論PCR技術簡史PCR技術的基本原理PCR反應體系與反應條件PCR反應特點PCR擴增產物的分析聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便重復性好易自動化等突出優點能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發一滴血甚至一個細胞中擴增出足量的供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。PCR技術簡史PCR的最早設想核酸研究已有100多年的歷史，本世60年代末、70代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想過DNA變性，與合適的引物雜交，DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因PCR的實現年美國公司人類遺傳研究室的等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應其原理類似于的體內復制只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件--摸板DNA，寡核苷酸引物DNA聚合酶適的緩沖體系變性性及延伸的溫度與時間。PCR的改進與完善Mullis最初使用聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點是：①Klenow不耐高溫90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異較差，合成的DNA片段不均一。此種以酶催化的術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow不耐熱在DNA模板進行熱變性時會導致此酶鈍化每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期給PCR技術操作程序添了不少困難這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一真實性也較高只有所期望的一種DNA段但每循環一次仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱聚合酶。酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應后其殘留活性大于原來的90%，在93℃反應2h其殘留活性是原來的60%，在℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率增加了擴增長度(2.0Kb)由于提高了擴增的特異性和效率因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區別將此酶命名為DNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。PCR技術的基本原理PCR技術的基本原理類似于DNA天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物PCR由變性--退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離使之成為單鏈以便它與引物結合為下輪反應作準備②模板DNA與引物的退火復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多“半保留復制鏈這種新鏈又可成為下次循環的模板每完成一個循環需～4分鐘2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍(Plateau)到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝PCR的反應動力學PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA擴增量可用Y＝(1＋X)n計算代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率代表循環次數擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，出“停滯效應這種效應稱平臺期數PCR增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的一個原始模板為例一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的(即“長產物片段)結合。引物在與新鏈結合時由于新鏈模板的5'端序列是固定的，就等于這次延伸的片段端被固定了止點保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內形成長短一致的“短產物片段難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。PCR反應體系與反應條件標準的反應體系：10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反應五要素：參加反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物是PCR特異性反應的關鍵產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物利用PCR就可將模板DNA體外大量擴增設計引物應遵循以下原則：①引物長度：15-30bp常用為20bp左右。②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至的片段。③引物堿基：G+C含量以為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對以避免因末端堿基不配對而導致PCR敗⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處引物的特異性應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增且可增加引物之間形成二聚體的機會。酶及其度目前有兩種DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶另一種為大腸菌合成的基因工程酶催化一典型的反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。dNTP質量與濃度dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0，小量分裝，℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。PCR反應中，dNTP為50～200umol/L，尤其是注意的濃度要相等(等摩爾配制，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)就會引起錯配濃度過低又會降低PCR產物的產量dNTP與Mg2+結合游離的Mg2+濃度降低。模板(基因)酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的純化方法通常采用和蛋白酶K來消化處理標本SDS的主要功能是溶解細胞膜上的脂類與蛋白質因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份用乙醇或異丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作為模板用于PCR反應一般臨床檢測標本可采用快速簡便的方法溶解細胞裂解病原體消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+度Mg2+對PCR增的特異性和產量有顯著的影響般反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高反應特異性降低出現非特異擴增濃度過低會降低DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。PCR應條件選擇PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。溫度與時間的設置基于PCR原理三步驟而設置變性退火-延伸三個溫度點在標準反應中采用三溫度點法90～95℃變性速冷卻40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因長度為100～300bp時可采用二溫度點法，除變性溫度外退火與延伸溫度可合二為一一般采用℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)①變性溫度與時間性溫度低鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因般情況下℃～94℃lmin以使模板變，若低于℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性就會導致PCR失敗②退火復性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸G+C含量約50%的引物55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復性溫度=Tm-(5～10℃)在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大減少引物和模板間的非特異性結合高反應的特異性。復性時間一般為30～60sec足以使引物與模板之間完全結合。③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子℃60核苷酸/S/酶分子℃24核苷酸/S/酶分子；高于90℃時，DNA合幾乎不能進行。PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間根據待擴增片段的長度而定般以內的DNA片段，延伸時間足夠的。3～4kb靶序列需3～4min；擴增需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。循環次數循環次數決定PCR擴增程度PCR循環次數主要取決于模板的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。PCR應特點特異性強：PCR反應的特異性決定因素為：①引物與模板特異正確的結合；②堿基配對原則；③Taq聚合酶合成反應的忠實性；④靶基因的特異性與保守性其中引物與模板的正確結合是關鍵引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行合的特異性大大增加被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。靈敏度高：產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮(pg=10-12)級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平從100個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR靈敏度可達個RFU(斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應用耐高溫的Taq聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析不一定要用同位素放射性污染易推廣。對標本的純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞DNA粗制品及總均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。PCR增產物分析PCR產物是否為特異性擴增，結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。凝膠電泳分析：PCR產物電泳，溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性PCR產物片段的大小應與預計的一致特別是多重，應用多對引物其產物片斷都應符合預訐的大小這是起碼條件瓊脂糖凝膠電泳：常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好條帶比較集中可用于科研及檢測分析。酶切分析：根PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。分子雜交：分子雜交是檢測PCR物特異性的有力證據，也是檢測PCR產物堿基突變的有效方法。Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針與PCR產物雜交此法既可作特異性鑒定又可以提高檢測PCR產物的靈敏度還可知其分子量及條帶形狀主要用于科研斑點雜交：將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交察有無著色斑點要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。第三節病毒核酸雜檢測技術互補的核苷酸序列通過Walson-Crick基配對形成穩定的雜合雙鏈分子分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的也可以在細胞內雜交,即細胞原位雜交探針必須經過標記以便示蹤和檢測使用最普遍的探針標記物是同位素,但由于同位素的安全性近年來發展了許多非同位素標記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選酶切圖譜的制作基因組中特定基因序列的定性定量檢測和疾病的診斷等方面因而它不僅在分子生物學領域中具有廣泛地應用,而且在臨床診斷上的應用也日趨增多。第一節核酸探針標記的方法核酸探針根據核酸的性質，可分為和RNA探針;根據是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況可分為均勻標記和末端標記探針。下面將介紹各種類型的探針及標記方法。一、雙鏈DNA探針及其標記方法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。1.切口平移法(nicktranslation)當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的羥基末端同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'除去核苷酸于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸將放射性同位素摻入到合成新鏈中最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響:(a)產物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性,故應使用仔細純化后的DNA。材料：待標記的DNA。設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：10×切口平移緩沖液:0.5mol/LTris·Cl(pH7.2);0.1mol/LMgSO4;10mmol/LDTT;100μg/mlBSA。未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其3種分別溶解于50mmol/LTris·Cl(pH7.5)溶液中,濃度為。[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP:400Ci/mmol,10μCi/μl。E.coli聚合酶Ⅰ(4單位/μl):溶于50μg/ml50%甘油，50mmol/LTris·Cl(pH7.5)中。DNA酶Ⅰ:1mg/ml。EDTA:200mmol/L(pH8.0)。10mol/LNH4Ac。操作步驟:(1)按下列配比混合:未標記的dNTP10μl、10×切口平移緩沖液5μl、待標記的DNA1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi)7μl、E.coliDNA聚合酶4單位酶I1μl，加水至終體積50μl置于15℃水浴分鐘。加入5μlEDTA終止反應。反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L,加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。[注意]1，32P及35S標的dNTP都可使用于探針標記但通常使用[α-32P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。2.隨機引物合成法隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA板結合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針合成產物的大小產量比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產物平均長度為個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是