化生專業微生物微生物的生長上傳第1頁/共83頁生長（growth）：生物個體物質有規律地、不可逆增加，導致個體體積擴大的生物學過程。繁殖（reproduction）：生物個體生長到一定階段，通過特定方式產生新的生命個體，引起生命個體數量增加的生物學過程。微生物生長（microbialgrowth）：在一定時間和條件下微生物細胞數量的增加。第2頁/共83頁Chapter7-1-測定生長繁殖的方法

（Methodsfordeterminingcelldensity

）微生物的生長情況通過測定單位時間里微生物數量或生物量（biomass）的變化來評價。通過對生長的測定可以客觀地評價培養條件、營養物質等對微生物生長的影響，或評價不同的抗菌物質對微生物作用的效果，也能客觀地反映微生物生長的規律。第3頁/共83頁通常用來測定細菌、酵母菌等單細胞微生物的生長情況或樣品中所含微生物個體的數量（細菌、孢子、酵母菌）。一、計數法（Counting）第4頁/共83頁1、菌落計數法（colony-countingmethod）第5頁/共83頁準備平板計數的平板的方法涂布法（spreadplate）混菌法（pourplate）一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細胞數。最常用的活菌計數法，原理是每個活細菌在適宜的培養條件下可以通過生長形成肉眼可見的菌落。第6頁/共83頁厭氧菌的菌落計數可以采用半固體深層瓊脂法。當樣品中菌數很低時，可以將一定體積的樣品（湖水、海水或飲用水等）通過膜過濾器，然后將將膜轉到相應的培養基上進行培養，對形成的菌落進行統計，這種方法稱為膜過濾培養法。第7頁/共83頁2、顯微鏡直接計數法（countingthemunderamicroscope）

第8頁/共83頁沒有計數板時，可將已知顆粒濃度的樣品與待測細胞細胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據二者之間的比例直接推算待測微生物細胞濃度。當樣品中菌數很低時，可將一定體積的樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上的菌數；采用特定的染色技術（如美藍染色）可分別對活菌和死菌進行分別計數；第9頁/共83頁二、生物量測定法

（Followtheamountofimportantcellularcomponent）通過對微生物群體濃度、重量和一些生理指標的測定來間接判斷微生物的生長情況，對多細胞微生物也可以測定。第10頁/共83頁原理是一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與渾濁度成正比，與透光度成反比。在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度（opticaldensity,即OD）表示菌量。1、比濁法（turbidity）

第11頁/共83頁以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法2、重量法（weight）

3、生理指標法（physiologicalindex）選擇測定與微生物生長量平行的生理指標，如蛋白質、核酸含量，呼吸強度，耗氧量、酶活性、生物熱等，來間接判斷微生物生長量。常用于對微生物的快速鑒定與檢測第12頁/共83頁Chapter7-2-微生物的生長規律

（RegularityofMicrobialGrowth）微生物能在各種環境條件下很快地生長繁殖，但受到各種因素的影響，其生長速率并不是穩定的，因此，并不能夠無限制地繁殖。在一個密閉容器中，微生物的群體生長顯示了一定的規律性。第13頁/共83頁一、單細胞微生物的典型生長曲線

（Traditionalgrowthcurveofsingle-cellmicrobe）生長曲線（Growthcurve）：定量描述液體培養基中微生物群體生長規律的實驗曲線。把少量純種單細胞微生物接種到定量的液體培養基中，定時取樣測定細胞數量，以培養時間為橫座標，以菌數的對數為縱座標作圖，得到的一條反映細菌在整個培養期間菌數變化規律的曲線。第14頁/共83頁根據微生物的生長速率常數，生長曲線可以分為：延滯期，對數期，穩定期和衰亡期等4個生長時期第15頁/共83頁也稱調整期、適應期，指將少量菌種接入新鮮培養基后，在開始一段時間內菌數不立即增加，或增加很少的一段時期。1、延滯期（lagphase）第16頁/共83頁（1）延滯期的特點分裂遲緩、代謝活躍生長速率常數為0；細胞形態變大或增長；細胞內RNA，尤其是rRNA含量增高；合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產生誘導酶。對外界不良條件反應敏感。例如巨大芽孢桿菌，在延滯期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于延滯期的細菌細胞體積最大。第17頁/共83頁（2）延滯期出現的原因微生物接種到一個新的環境，暫時缺乏分解和催化有關底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產物等。為產生誘導酶或合成中間代謝產物，就需要一段適應期。調整代謝第18頁/共83頁（3）縮短延滯期的方法

通過遺傳學方法改變種的遺傳特性；利用對數生長期的細胞作為種子；接種前后所使用的培養基組成不要相差太大；適當擴大接種量。延滯期的長短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前后所處的環境條件等因素有關，短的只需要幾分鐘，長的需數小時。第19頁/共83頁2、對數期（logphase）又稱指數生長期（exponentialphase），指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數以幾何級數增長的時期。第20頁/共83頁生長速率常數最大，代時最短；細胞進行平衡生長，菌內各成分十分均勻；酶系活躍，代謝旺盛。（1）對數期的特點對數生長期的細菌個體形態、化學組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速、代時穩定，所以是研究微生物基本代謝的良好材料。它也常在生產上用作種子，使微生物發酵的遲緩期縮短，提高經濟效益。第21頁/共83頁繁殖代數（n）：一定時間內細胞分裂的次數。生長速率常數（growthrateconstant，R）：單位時間內細胞分裂的次數。代時（Generationtime，G）：在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間。倍增時間（Doublingtime）：在群體生長里細菌數量增加一倍所需的時間。（2）對數期的重要參數第22頁/共83頁（3）影響代時的因素菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同；營養成分：在營養豐富的培養基中生長代時短；營養物濃度：一定范圍內，營養物濃度既影響生長速率也影響總生長量；溫度：一定范圍，生長速率與培養溫度呈正相關。第23頁/共83頁又稱恒定期或最高生長期，生長速率常數降為0（即細菌分裂增加的數量等于細菌死亡數），菌體產量達到最高點。3、穩定期（stationaryphase）第24頁/共83頁生長速率常數為0，菌體產量達到最高點；儲存糖原等細胞質內含物；積累代謝產物的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也在此時期；

芽孢桿菌在此階段形成芽孢或建立自然感受態等。（1）穩定期的特點生產上常通過補充營養物質或取走代謝產物、調節pH、調節溫度、對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩等措施延長穩定生長期，以獲得更多的菌體物質或積累更多的代謝產物。第25頁/共83頁（2）穩定期出現的原因營養物特別是生長限制因子的耗盡；

營養物比例失調；酸、醇、毒素等有害代謝物的積累；pH、氧化還原電位等物理化學條件不適宜；第26頁/共83頁細菌個體死亡速率超過新生速率，整個群體呈現出負增長（R為負值）。4、衰亡期（decline或deathphase）第27頁/共83頁

R為負值；細胞呈現多種形態，如產生畸形，大小懸殊，革蘭氏染色反應變化等；細菌衰老并出現自溶，產生或釋放出一些產物，如氨基酸、轉化酶、外肽酶或抗生素等。（1）衰亡期出現的原因營養物質耗盡和有毒代謝產物的大量積累；（2）衰亡期的特點第28頁/共83頁二、連續培養、同步培養和高密度培養連續培養（continuousculture）：又稱開放培養（openculture），是指在一個恒定容積的流動體系中培養微生物，一方面以一定流速不斷加入新的培養基，另一方面又以同樣的流速流出培養物，使體系中的細胞數量和營養狀態保持恒定的培養方法。第29頁/共83頁培養過程中不斷的補充營養物質和以同樣的速率移出培養物是實現微生物連續培養的基本原則。控制連續培養的方法恒濁連續培養菌體濃度恒化連續培養營養物質濃度第30頁/共83頁同步培養（Synchronousculture）：使群體中的細胞處于比較一致的，生長發育均處于同一階段上，即大多數細胞能同時進行生長或分裂的培養方法。高密度培養（HCDC）：也稱高密度發酵，一般是指微生物在液體培養中細胞群體密度超過常規培養10倍以上時的生長狀態或培養技術。第31頁/共83頁Chapter7-3-微生物的培養法概論

（OverviewofMicrobialCulturing）不同微生物有不同培養條件的需求，良好的微生物培養裝置的基本條件是：按微生物的生長規律進行科學設計，能在提供豐富而均勻的營養物質的基礎上，保證微生物獲得適宜的理化條件，以及嚴防雜菌污染。第32頁/共83頁微生物培養技術的發展從小規模培養到大規模培養；從固體培養到液體培養；從單批培養到連續培養；從利用微生物細胞到利用動植物細胞培養；從利用野生型菌株到變異菌株和遺傳工程菌株；從單菌發酵到混菌發酵；從低密度培養到高密度培養；從人工控制的發酵罐到自動化發酵罐。第33頁/共83頁一、實驗室培養

（Culturemethodsinlaboratory）1、固體培養法（onsolidmedium）（1）好氧菌（aerobes）主要用試管斜面（test-tubeslant）、培養皿瓊脂平板（agarplate）及較大型的克氏扁瓶（kolleflask）、茄子瓶等進行平板培養。第34頁/共83頁（2）厭氧菌（anaerobes）培養厭氧菌需要特殊的培養裝置和特殊的培養基。用培養厭氧菌的方法主要有：高層瓊脂柱、厭氧培養皿、Hungate滾管技術、厭氧罐（anaerobicjar）技術、厭氧手套箱（anaerobicglovebox）

。第35頁/共83頁2、液體培養（inliquidmedium）（1）好氧菌（aerobes）氧的供應是好氧菌生長繁殖的限制因子，為保證溶解氧濃度，必須增加培養液和氧的接觸面或提高氧分壓：淺層培養；振蕩培養；深層液體培養器的底部通入加壓空氣；對培養液進行機械攪拌。第36頁/共83頁（2）厭氧菌（anaerobes）在培養基中加還原劑（如巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C或庖肉等、鐵絲等）；用深層培養并或在液面上封以凡士林-石蠟層；放入厭氧罐或厭氧手套箱中培養。第37頁/共83頁二、生產實踐中的培養

（Culturemethodsinindustryproduction）1、固態培養法（onsolidmedium）好氧菌的曲法培養；厭氧菌的堆積培養法2、液體培養法（inliquidmedium）好氧菌的淺盤培養（shallowpancultivation）深層液體培養——發酵罐（fermenter）第38頁/共83頁生長是微生物與外界環境因素共同作用的結果。環境條件的改變，在一定限度內，可引起微生物形態、生理、生長、繁殖等特征的改變。當環境條件的變化超過一定極限，則導致微生物的死亡。Chapter7-3-環境對微生物生長的影響

（EnvironmentalEffectsonGrowth）主要因素：營養條件、理化因素、生物因素第39頁/共83頁一、溫度（Temperature）不同微生物的生長溫度范圍有寬有窄，但都有最低生長溫度，最適生長溫度，最高生長溫度這3個重要指標，即生長溫度三基點（threecardinalpoint）。把微生物作為一個整體來看，其溫度的三基點極其寬。第40頁/共83頁根據生長溫度的范圍，可把微生物分為寬溫微生物和窄溫微生物。最適生長溫度（optimumgrowthtemperature）：某種微生物分裂代時最短或生長速率最高時的培養溫度。第41頁/共83頁嗜冷微生物兼性嗜冷微生物嗜溫微生物嗜熱微生物超嗜熱微生物第42頁/共83頁二、氧氣（Oxygen）好氧菌（aerobes）厭氧菌（anaerobes）專性好氧菌（obligateaerobes）兼性厭氧菌（facultativeanaerobes）微好氧菌（microaerophilicbacteria）耐氧菌（aerotolenrantanaerobes）厭氧菌（anaerobes）第43頁/共83頁氧對不同微生物在半固體瓊脂柱中生長的影響effectofoxygenconcentrationonthegrowthofvariousbacteriain

tubesofsemi-solidmedium

第44頁/共83頁厭氧菌的氧毒害機制——超氧化物歧化酶（SOD）學說嚴格厭氧菌無SOD活力，無過氧化氫酶活力；好氧菌有SOD活力，有過氧化氫酶活力；耐氧菌有SOD活力，有過氧化物酶活力；O2－+2H+H2O2+O2H2O+1/2O22H2O過氧化氫酶過氧化物酶SOD第45頁/共83頁三、pH值（pHvalue）微生物作為一個整體來說，其生長的pH范圍極廣（2~10），少數種類還可以超出此范圍。但絕大多數微生物的生長pH在5~9之間，不同微生物生長的pH也存在最高、最適和最低3個數值。第46頁/共83頁微生物類型pH范圍舉例嗜酸微生物2.0—4.0氧化硫硫桿菌、嗜酸熱硫化葉菌、隱蔽熱網菌；耐酸微生物3.5—6.0醋桿菌屬、乳桿菌屬、多類真菌；嗜中性微生物6.0—8.0多數微生物在中性pH的環境中生長良好；但多數細菌宜偏堿性（pH8左右）；

例如產堿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、硝化細菌、放線菌等；嗜堿性微生物9.0—10.0嗜鹽堿桿菌屬、外硫紅螺菌屬、某些芽孢桿菌；第47頁/共83頁Chapter7-5-有害微生物的控制

（ControlofHarmfulMicrobe）在我們周圍的環境中，到處都有各種微生物存在，其中有一部分是對人類有害的。它們通過多種方式傳播到合適的基質上造成種種危害，所以控制（有害）微生物的生長速率或消滅不需要的微生物，在實際應用中具有重要的意義。第48頁/共83頁

抑制宿主體內的病原菌殺死所有微生物（包括芽孢）

殺死病原微生物（營養體細胞）

抑制霉腐微生物抑制（inhibition）：生長停止殺死（killing）：生長能力不可逆喪失控制措施防腐（antisepsis）化療（chemotherapy）消毒（disinfection）滅菌（sterilization）第49頁/共83頁一、基本概念（Basicconceptions）1、滅菌（sterilization）采用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施。例如高溫滅菌和輻射滅菌。第50頁/共83頁2、消毒（disinfection）采用較溫和的理化因素，殺死物體表面或內部一部分對人體或動植物有害的病原菌，而對被處理對象基本無害的措施。例如一些常用的對皮膚、水果、飲用水進行藥劑消毒的方法和對啤酒、牛奶、果汁等進行的巴氏消毒法。第51頁/共83頁3、防腐（antisepsis）利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，即通過制菌作用（bacteriostasis）防止食品、生物制品等對象發生霉腐的措施。低溫：冰箱；缺氧：抽真空、充氮干燥：曬干、烘干；高滲：鹽腌、糖漬高醇度：用酒泡；高酸度：泡菜；加防腐劑：苯甲酸、山梨酸第52頁/共83頁4、化療（chemotherapy）即化學治療，是指利用具有高選擇毒力即對病原菌具有高度毒力而對宿主基本無毒的化學物質來抑制宿主體內的病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該宿主傳染病的措施。用于化療的化學物質稱為化學治療劑，有化學合成藥物、抗生素、生物藥物素和中草藥有效成分等。第53頁/共83頁物理滅菌因素的種類很多，主要是高溫、輻射、超聲波、微波、激光和靜電壓等。另外通過稀釋、過濾等物理措施也能除菌。其中，高溫是最常用、方便、有效的方法。二、物理滅菌因素的代表——高溫第54頁/共83頁高溫的致死作用，主要是引起蛋白質、核酸和脂類等重要生物大分子發生降解或空間結構改變，從而變性或破壞。1、高溫滅菌的種類干熱滅菌（dryheatsterilization）濕熱滅菌（moistheatsterilization）

第55頁/共83頁一種最徹底的干熱滅菌法，破壞力很強，應用范圍只局限于接種環、接種針的滅菌或帶病原菌的材料和動物尸體的燒毀。（1）灼燒法（incineration）把金屬器械和洗凈的玻璃器皿放在電熱烘箱中，連續在160℃下處理2個小時以上，可達到徹底滅菌的目的。（2）烘箱滅菌法（dryheatinoven）第56頁/共83頁在相同作用溫度和時間下，濕熱滅菌比干熱滅菌更有效，因為蒸汽穿透性力強，能破壞保持蛋白質空間結構和穩定性的氫鍵，加速變性，而且還存在潛熱。濕熱滅菌對一般營養體和孢子的殺滅條件：多數細菌和真菌的營養細胞：60℃左右，5-10分鐘；酵母菌和真菌的孢子：80℃以上，5-10分鐘；細菌的芽孢：121℃，15分鐘以上；第57頁/共83頁（3）巴氏消毒法（pasteurization）是一種低溫濕熱消毒法，一般是60-85℃處理15秒至30分鐘。具體方法可以分為兩類：低溫維持法（LTH）是在63℃維持30min，高溫瞬時法（HTST）是在72℃下保持15s。專門用于啤酒、牛奶、果酒和醬油等不宜進行高溫滅菌的液態風味食品或調料的消毒，可殺滅物料中的無芽孢病原菌而不影響風味。第58頁/共83頁（4）煮沸消毒法（boiling）

100℃下煮沸幾分鐘。用于飲用水的消毒。（5）間歇滅菌法（intermittentboiling）將待滅菌的培養基在80~100℃下蒸煮15~60min，然后室溫保存或37℃保溫過夜，第二天再同法蒸煮并保溫過夜，連續重復3天即可在較低溫度下達到徹底滅菌的效果。用于不耐熱培養基的滅菌。第59頁/共83頁（6）常規加壓蒸汽滅菌法（normalautoclaving）也稱為“高壓蒸汽滅菌法”，操作簡便、效果可靠，被廣泛使用。待滅菌物件放在盛有適量水的加壓滅菌鍋內，加熱煮沸，當蒸汽將鍋內的空氣驅盡，鍋蓋的閥門關閉后，溫度可以上升到100℃以上，達到較好的滅菌效果。一般條件是121℃，15分鐘或115℃，30分鐘。第60頁/共83頁（7）連續加壓滅菌（continuousautoclaving）也稱“連消法”，用于大型發酵廠的大批培養基滅菌。讓培養基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻，然后流進發酵罐。一般條件是135-150℃，5-15秒。第61頁/共83頁十倍致死時間（decimalreductiontime，DRT）：

在一定溫度條件下，微生物數量十倍減少所需要的時間。熱致死時間（thermaldeathtime，TDT）：

在某溫度下，殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最短時間。熱致死溫度（thermaldeathpoint，TDP）：

在10min內，殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最低溫度。2、定量指標第62頁/共83頁3、影響加壓蒸汽滅菌效果的因素滅菌物體含菌量滅菌鍋內空氣排除的程度滅菌對象的pH滅菌對象的體積加熱與散熱的速度第63頁/共83頁能夠制菌和殺菌的化學物質很多，有生物合成的天然產物，也有人工合成的化合物。根據對宿主細胞毒力的選擇性，可以分為表面消毒劑和抗代謝藥物、抗生素、生物藥物素兩大類。三、化學殺菌劑、消毒劑和治療劑第64頁/共83頁評價化學物質的藥效和毒性的3個主要指標最低抑制濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）：一定條件下，某化學藥劑抑制指定微生物的最低濃度。半致死劑量（50%lethaldose，LD50）：一定條件下，某化學藥劑能殺死50%試驗生物時的劑量。最低致死劑量（minimumlethaldose，MLD）：一定條件下，某化學藥劑能引起試驗生物群100%死亡率的最低劑量。第65頁/共83頁藥效測定方法——最低抑制濃度試驗（液體培養法）第66頁/共83頁藥效測定方法——抑菌圈（zoneofinhibition）試驗（平板培養法）第67頁/共83頁是指對一切活細胞都有毒性，不能用于活細胞或機體內治療用的化學藥劑。為比較各種表面消毒劑的相對殺菌強度，常用在臨床上最早使用的消毒劑——石炭酸作為比較標準。1、表面消毒劑（surfacedisinfectant）石炭酸系數（phenolcoefficient，P.C.）：指在一定時間內被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度和達到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規定處理時間為10分鐘，供試菌為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。第68頁/共83頁常用消毒劑按殺菌作用強弱可分為3大類：

1、高效消毒劑：過氧乙酸和含氯消毒劑等。2、中效殺毒劑：乙醇、碘伏（強力碘）、碘酊和煤酚皂液（來蘇兒）等。3、低效消毒劑：氯已定（洗必泰）、苯扎溴胺（新潔爾滅）、玉潔新（三氯散）和高錳酸鉀等。殺菌能力越強的消毒劑，其刺激性、毒性和腐蝕性往往也隨之增大。在家庭中一般是使用中效和低效的消毒劑。第69頁/共83頁化學消毒劑的作用機制主要有3個方面：1、改變細胞膜通透性：表面活性劑、酚類及醇類。2、蛋白變性或凝固失去生物活性，導致細菌死亡：如乙醇、大多數重金屬鹽、氧化劑、醛類、染料和酸堿等。3、改變蛋白與核酸功能基團，使菌體酶蛋白失去酶的活性：某些氧化劑和重金屬鹽類能與細菌的-SH基結合并使之失去活性。第70頁/共83頁又稱代謝拮抗物或代謝類似物，是一類在化學結構上與生物體所必需的代謝物很相似，并可干擾正常代謝活動的化學物質。有良好的選擇毒力，是重要的化學治療劑。葉酸對抗物（磺胺）；嘌呤對抗物（6-巰基嘌呤）；苯丙氨酸對抗物（對氟苯丙氨酸）；尿嘧啶對抗物（5-氟尿嘧啶）；胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶）。2、抗代謝物（antimetabolite）第71頁/共83頁磺胺藥物是最早發現，也是最常見的化學療劑，抗菌譜廣，能治療多種傳染性疾病。對大多數革蘭氏陽性細菌（如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等），某些革蘭氏陰性細菌（如痢疾桿菌、腦膜炎球菌、流感桿菌等），對放線菌也有一定的作用。1934年，德國I.G.Farben染料廠的G.Domagk發