分子生物學(xué)研究方法第1頁/共63頁3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。第2頁/共63頁酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個(gè)切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團(tuán)重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶第3頁/共63頁

1.至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。

2.

至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。

3.

至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

4.安全性（一）特點(diǎn)基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞自主復(fù)制的DNA分子。一、載體第4頁/共63頁（二）類型1、質(zhì)粒載體常用的克隆載體、雙鏈環(huán)狀的DNA分子（也有線性的）、能獨(dú)立地自我復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn):①分子量小，穩(wěn)定存在，較高拷貝數(shù)；②遺傳標(biāo)志；③內(nèi)切酶點(diǎn)。第5頁/共63頁（1）pBR322質(zhì)粒載體123來源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）第6頁/共63頁（2）pUC質(zhì)粒載體氨芐青霉素抗性基因(ampr)，大腸桿菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）第7頁/共63頁（3）pGEM-3Z質(zhì)粒第8頁/共63頁2、噬菌體

（1）噬菌體的生物學(xué)特性溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。(烈性噬菌體只具有溶菌生長周期)溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。(溫和噬菌體具有溶源生長周期和溶菌生長周期)第9頁/共63頁（2）λ噬菌體A.生物學(xué)特性

組成：蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。DNA長度為48502bp，在分子兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)（cohesiveendsite）。第10頁/共63頁

溫和噬菌體一般以溶源生長進(jìn)行增殖，脅迫條件下也會(huì)進(jìn)入溶菌生長周期。

復(fù)制溶源周期隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制溶菌周期的早期是“θ”復(fù)制，晚期進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制

基因組成DNA至少包括61個(gè)基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分約1／3為非必須區(qū)段。

第11頁/共63頁B.類型插入型（Insertionvectors）這種載體僅僅有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。如：λgt10、λgt11克隆能力小，不到10kb置換型（Replacementvectors）這種載體具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon4載體克隆能力大，20～25kb第12頁/共63頁（3）M13噬茵體生物學(xué)特性單鏈閉合環(huán)狀噬菌體只能感染雄性細(xì)菌，外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb，可分為10個(gè)區(qū)和507bp基因間隔區(qū)（IS區(qū)），該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會(huì)影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。第13頁/共63頁復(fù)制與增殖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的M13（＋）鏈DNA，便起到一種模板的作用，合成出互補(bǔ)的（一）鏈DNA。由此形成的雙鏈形式的M13DNA，稱為復(fù)制型DNA。它按θ形式進(jìn)行幾輪復(fù)制之后，基因Ⅱ的產(chǎn)物便在RFDNA的正鏈待定位點(diǎn)上作切割反應(yīng)，形成一個(gè)缺口。這樣，M13基因組的擴(kuò)增活動(dòng)便正式開始啟動(dòng)。其基本特點(diǎn)是利用大腸桿菌的DNA聚合酶I，以環(huán)形的MI3（一）DNA為模板合成M13（＋）DNA。當(dāng)DNA復(fù)制叉沿著模板DNA分子轉(zhuǎn)移到復(fù)制終點(diǎn)時(shí)，在基因Ⅱ編碼產(chǎn)物的作用下，新合成的（十）DNA便會(huì)被切除下去，并進(jìn)一步環(huán)化形成單位長度的M13基因組DNA第14頁/共63頁3、柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒(cosmid)又稱粘粒，是由λDNA的cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，具有質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為雙鏈、環(huán)狀DNA?！癱osmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒。因此我們說，所謂柯斯質(zhì)粒其實(shí)是一類由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。第15頁/共63頁柯斯質(zhì)粒具有下列特點(diǎn)：①具有質(zhì)粒載體的特性。②帶有λ噬菌體的粘性末端(cos區(qū))。③一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)。④具有高容量的克隆能力。⑤非重組體粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而有利于重組體的篩選。第16頁/共63頁4、病毒載體類型：1、重組型病毒載體

2、無病毒基因的病毒載體復(fù)制缺陷型可復(fù)制型復(fù)制缺陷型組成：1、病毒復(fù)制和包裝元件

2、病毒基因

3、插入的外源基因或元件

4、病毒外殼/外膜第17頁/共63頁常用的病毒載體的特點(diǎn)：病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體

單鏈RNA病毒

8~10kb可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中；表達(dá)時(shí)間較長；有致癌的危險(xiǎn)；Exvivo基因治療；腫瘤基因治療。腺病毒載體

雙鏈DNA病毒

36kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；不整合到染色體中；外源基因表達(dá)水平高；表達(dá)時(shí)間較短；免疫原性強(qiáng)；Invivo基因治療；腫瘤基因治療；疫苗。AAV病毒載體

單鏈DNA病毒

~5kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；整合到染色體中；無致病性；免疫原性弱；可長期表達(dá)外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高；Invivo基因治療；Exvivo基因治療；遺傳病基因治療；獲得性慢性疾病的基因治療。HSV病毒載體

雙鏈DNA病毒

152kb具有嗜神經(jīng)性；可逆軸突傳遞；可潛伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療；腫瘤的基因治療。第18頁/共63頁優(yōu)點(diǎn)：1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；

2、復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成；

3、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。第19頁/共63頁二、質(zhì)粒DNA的提取1、細(xì)菌的收獲含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)1.5ml離心管—離心沉淀細(xì)胞2、細(xì)菌的裂解（1）堿裂解法（2）煮沸法第20頁/共63頁（1）堿裂解法堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是根據(jù)Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修訂而成。優(yōu)點(diǎn)：收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。 基本原理：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。第21頁/共63頁純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法，但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。三、質(zhì)粒DNA的純化第22頁/共63頁上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí)穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥氯化銫密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞裂解及DNA分離的過程中，大分子量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。這種差別對(duì)質(zhì)粒DNA的純化是十分有用的。第23頁/共63頁缺點(diǎn)

通過氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但它操作復(fù)雜，需要價(jià)格昂貴的氯化銫和超速離心機(jī)設(shè)備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質(zhì)，如果操作不慎，不僅會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)危及實(shí)驗(yàn)工作人員的身心健康。第24頁/共63頁根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。Ⅰ類和Ⅲ類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。Ⅰ類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識(shí)別位點(diǎn)，且沒有特定的切割位點(diǎn)，酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。Ⅲ類限制性內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割，然后從底物上解離下來。故Ⅰ類和Ⅲ類酶在基因工程中基本不用。1、限制酶的類型四、DNA酶切第25頁/共63頁Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶.它們能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識(shí)別順序一般為４～６個(gè)堿基對(duì)的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序；Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才使得人們能在體外有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。第26頁/共63頁第27頁/共63頁（一）DNA的連接1、DNA連接酶T4DNA連接酶（需要ATP作為輔助因子）主要用于：（1）連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段；（2）雙鏈DNA分子間的平端；（3）在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。2、粘性末端連接連接后可能出現(xiàn)以下問題：（1）載體自身環(huán)化，造成假陽性背景克隆，為避免此問題，可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA5’-端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發(fā)生連接；（2）插入片段可雙向插入；（3）插入片段可多拷貝插入。五、DNA的連接和轉(zhuǎn)化第28頁/共63頁3、平端連接平端連接的優(yōu)點(diǎn)是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對(duì)不同DNA分子的連接十分有利。平端連接的主要問題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促進(jìn)平端連接反應(yīng)。4、人工接頭連接5、利用適配子連接第29頁/共63頁（二）重組DNA的轉(zhuǎn)化1、轉(zhuǎn)化指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。第30頁/共63頁（1）將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。步驟：（2）與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。（3）立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。第31頁/共63頁（5）涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。（4）在全培養(yǎng)基中生長一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù)第32頁/共63頁2、轉(zhuǎn)染和感染感染：在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。轉(zhuǎn)染：在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。第33頁/共63頁（一）抗藥性標(biāo)志的篩選（二）β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選

（三）菌落快速裂解鑒定法（四）內(nèi)切酶圖譜鑒定

（五）通過聚合酶鏈反應(yīng)篩選重組子（六）菌落或噬菌斑原位雜交六、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定第34頁/共63頁第四節(jié) 分子雜交技術(shù)雜交(hybridization)：來源不同的兩條彼此的鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。（注意與復(fù)性的區(qū)別）第35頁/共63頁在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。分子雜交是目前分子生物學(xué)最廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。利用此技術(shù)，可以求出特定基因的頻率、基因組織的特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)和定位、基因表達(dá)等。

電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法第36頁/共63頁E.M.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的。材料： 尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）步驟：第一，將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上－核酸印跡轉(zhuǎn)移第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行雜交一、Southern印跡雜交

第37頁/共63頁SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.結(jié)果檢測第38頁/共63頁二、Northern印跡雜交

是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。第39頁/共63頁三、斑點(diǎn)雜交

第40頁/共63頁Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopment四、Western印跡雜交

第41頁/共63頁五、原位雜交（教材P175）

組織原位雜交簡稱原位雜交（insituhybridization），是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與RNA或DNA雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行?；静襟E是通過適當(dāng)處理使細(xì)胞滲透性增加，探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法或熒光顯示雜交結(jié)果。第42頁/共63頁LocalizationofDNALocalizationofRNA第43頁/共63頁六、基因芯片基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。(教材p.214-218)第44頁/共63頁（一）基因芯片的種類1、光引導(dǎo)原位合成技術(shù)生產(chǎn)寡聚核苷酸微陣列2、微電子芯片3、微量點(diǎn)樣技術(shù)4、其他技術(shù)第45頁/共63頁（二）應(yīng)用領(lǐng)域1、科研領(lǐng)域2、生物制藥領(lǐng)域3、醫(yī)學(xué)診斷第46頁/共63頁七、酵母雜交技術(shù)（一）酵母雙雜交技術(shù)1、基本原理2、改進(jìn)和發(fā)展(教材p.206-208)第47頁/共63頁第48頁/共63頁（二）酵母單雜交技術(shù)1、酵母單雜交技術(shù)的原理2、酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用第49頁/共63頁第五節(jié)、基因擴(kuò)增與定點(diǎn)突變技術(shù)一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）(教材p.165-170)第50頁/共63頁（一）PCR反應(yīng)中的主要成份1、DNA模板2、dNTPs3、引物4、Mg++6、反應(yīng)緩沖液5、DNA聚合酶第51頁/共63頁引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：長度約為16-30bp;G+C含量通常為40%-60%;

四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布;3‘端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位 核苷酸對(duì)應(yīng),以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì);在引物內(nèi),尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu);兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ);5'端可增加酶切位點(diǎn);引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ);簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子。第52頁/共63頁TargetSequence（二）PCR反應(yīng)參數(shù)1、變性第53頁/共63頁TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’2、退火第54頁/共63頁TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase3、延伸第55頁/共63頁TargetSequenceTargetSequence4、循環(huán)次數(shù)

第56頁/共63