第三章

環境毒理學的基本探討方法毒理學試驗調查探討毒理學

試驗基礎

探討方法流行病學探討受控的臨床探討毒理學體內試驗毒理學體外試驗優點·真實的暴露條件·規定的限定暴露條·易于限制暴露條件·影響因素少，易于控·在各化學物之間發生相·在人群中測定反應·能測定多種效應制互作用·對某組人群(如哮喘)·能評價宿主特征的作用·可進行某些深化的研·測定在人群的作用的探討是有力的(如：性別、年齡、遺究(如：機制，代謝)·表示全部的人敏感性·能測定效應的強度傳特征等和其他調控因·人力物力花費較少素飲食等)·能評價機制缺點·耗資、耗時多·耗資多·動物暴露與人暴露相關·不能全面反映毒作用·多為回顧性，無健康·較低濃度和較短時的不確定性不能作為毒性評價和愛護間的暴露·受控的飼養條件與人的危急性評價的最終依·難以確定暴露，有混雜·限于較少量的人群實際狀況不一樣據暴露問題(一般<50)·暴露的濃度和時間的模·難以視察慢性毒作用·可檢測的危急性增加必·限于短暫、微小、式顯著地不同于人群的需達到2倍以上可逆的效應暴露·測定指標較粗(發病率，·一般不適于探討最死亡率)敏感的人群毒理學探討方法的優缺點1試驗動物和人對外源化學物的反應敏感性不同，有時甚至存在著質的差別2高劑量向低劑量外推的不確定性3小數量試驗動物到大量人群外推的不確定性4成年健康動物向年老體弱及患病個體外推的不確定性試驗動物的毒理學試驗資料外推到人群接觸的平安性時的不確定性1化學物在試驗動物產生的作用，可以外推于人。基本假設①人是最敏感的動物物種；②人和試驗動物的生物學過程與體重(或體表面積)相關。2試驗動物必需暴露于高劑量，這是發覺對人潛在危害的必需的和牢靠的方法。

3成年的健康(雄性和雌性未孕)試驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。描述毒理學試驗的基本原則1受試物毒作用的表現和性質

2劑量—反應(效應)探討

3確定毒作用的靶器官

4確定損害的可逆性毒理學毒性評價試驗的基本目的試驗動物（laboratoryanimal）指經人工培育，對其攜帶微生物實行限制，遺傳背景明確，來源清晰，可用于科學探討的動物。試驗動物的選擇試驗動物的選擇物種選擇

選擇對外液化學物的毒性反應及代謝特點與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇易于飼養和試驗操作的物種；選擇經濟并易于獲得的物種。

近交系動物連續20代以上兄妹交配或親子交配培育突變系動物突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性雜交群動物兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產生的第一代動物，亦稱雜交一代動物。封閉群動物5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群

試驗動物的選擇品系選擇無菌動物體內外均無任何微生物和寄生蟲無特定病原體動物（SPF）體內無特定微生物和寄生蟲存在的動物(無傳染病)。飼養于封閉的系統。清潔動物與SPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應有臨床癥狀、病理變更及自然死亡。飼養在半屏蔽系統。微生物限制的選擇試驗動物的選擇個體選擇

1年齡2性別3生理狀態4健康狀況

試驗動物的選擇

品系周齡 Wistar SD 雌性 雄性 雌性 雄性 3 54 56 50 52 4 91 97 86 101 5 134 134 130 150 6 166 187 172 206 7 209 233 210 262 8 214 297 240 318 9 232 325 258 365 10 246 370 272 399 大鼠體重與周齡的關系

小鼠體重與周齡的關系

品系周齡 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性

0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00 5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58 6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96 7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96 8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83 1未處理比照組(空白比照組)：本底值，質量限制2陰性(溶劑／賦形劑)比照：與染毒組比較的基礎3陽性比照：檢測試驗體系的有效性4歷史性比照：檢查試驗體系的穩定性，即進行試驗室質量限制和保證

毒理學試驗常用比照對各個毒理學試驗應當用同一種、同一批號受試物受試物成分和配方必需固定

如是異構體混合物，異構體比例必需固定

活性成分的百分含量和可檢測的雜質的濃度也應固定

受試物在貯存期內穩定性和在飼料中的穩定性必需進行探討并報告

受試物應一次備齊全部試驗的用量受試樣品毒理學試驗設計的統計學要求隨機、重復、比照原則對常規毒理學試驗資料的統計學方法計量資料：一般用t檢驗或ANOVA記數資料：卡方檢驗毒理學試驗的統計學1處理組與比照組比較差別有無顯著性2有無劑量-反應關系3是否伴有其他相關參數的變更4是否在“正常”值范圍試驗結果的推斷第一節急性毒性試驗一、急性毒性試驗的目的：1、確定供試化學物急性毒性的劑量—反應關系和中毒特征；2、求LD50或LC50,為急性毒性評價供應依據。3、探討毒物的毒動學和毒效學過程。表示急性毒性大小：

LD50(對受試物的個體感受性影響較小，有更高的重現性)二、試驗程序與評價1．動物選擇：首選受試物在體內代謝狀況與人體內相近的或對受試物最敏感的品系。一般：以哺乳動物為主，常用大鼠、小鼠；經皮：兔、豚鼠、豬應對兩種性別、成年和幼年動物進行測定。選擇兩種以上的試驗動物，最好一為嚙齒類，一為非嚙齒類。(目的：核對種間差異)2．染毒途徑與方式：一般與人的接觸途徑相同。(1)經口染毒：常用灌胃法，也可將受試物放在飲水中由動物自由攝取。(2)經呼吸道染毒：將試驗動物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內進行染毒。急性吸入染毒接受靜式染毒瓶(柜)，染毒2—4h。(3)經皮膚染毒：主要用于化學物經皮(或粘膜)吸取所引起的急性毒性。正式給藥前24h，背部脫毛，勿傷皮膚。將受試物勻整涂布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。3．試驗程序：（1）劑量與分組①預試驗：找出受試物大致致死量范圍(死亡率為10%~90%)；例：欲做化合物A的經口預試驗。化合物B的化學結構與A相像，已知B的=LD50=40(預期毒性中值)。則預試驗取2.5、10、40、160、640(上下各推1~2組，組距應較大，初始4倍差)

③求LD50正式試驗：在LD100與LD0之間設5—7個劑量組。

組距(對數)

或式中：n------設計的劑量組數（2）癥狀視察時間：24h或兩周內的反應三、LD50的計算與結果評價

計算方法：概率單位法和寇氏法。LD50值愈小，毒性愈大。概率單位法存在正態曲線關系。標準正態差d=(x-μ)/δ式中：x——劑量對數；μ——劑量對數均數δ——標準差d=0，左邊面積(死亡率)為50％，右邊面積(存活率)50％d=1，死亡率為84.13％，d=2，死亡率為97.73％,d＞2，死亡率接近100％。d=一1，死亡率為15.87％。d=一2，死亡率為2.27％。d＜一3，死亡率接近0。從上表，可以任一死亡率換算為相應的概率單位。A：劑量對數~死亡百分率B：劑量對數~概率單位LC50計算步驟如下：a.依據死亡率查概率單位(死亡率為100％或0％不計)b.繪圖求回來方程。c.求y=5的濃度對數（m），其反對數即為LC50y=2.78x-2.76同理可得LC5、LC10、……d.求LC50的可信限先求LC50的標準誤差(Sm)：S(校準差)=1/k本例中：S=1/2.78

平均致死量法（又名寇氏法）

試驗要求：①每個試驗組動物數相同；②各組劑量按等比級數分組；③最大劑量的死亡率最好為100％或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0％或與之接近。式中：Xm——最大劑量的對數值；i—相鄰劑量比值的對數；——各組死亡率的總和（以小數表示）。例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性試驗結果如下表所示，求LD50式中：p——一個組死亡率；q——一個組存活率；i——相鄰劑量比值的對數；h——各組動物數。其次節亞慢性和慢性毒性試驗一、蓄積試驗及其方法：（一）蓄積作用：某些物質以較小劑量反復作用于機體，可使機體對該物質的反應性增加，即一次染毒不引起明顯中毒反應或死亡的劑量，經分次重復染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現象稱為蓄積作用(accumulation)。可分兩種：物質蓄積：毒物在體內的排出量小于進入量，以致毒物在體內的貯留量增多為物質蓄積；功能蓄積：毒物進入機體后，并未發覺在體內明顯貯留，但可引起機體功能變更的漸漸累積，導致對該毒物的反應性增加。耐受性(tolerance)：機體多次接觸化學物質后．對該物質產生反應性減弱的現象，顯示不易發生慢性中毒。

（二）蓄積作用的測定方法有多種，常用蓄積系數法。蓄積系數(accumulationcoefficient)K：

ED50(n)——多次染毒使半數動物出現某種效應的總劑量;ED50(1)——一次染毒引起同一效應半數效量。若以死亡為毒效應指標，上式為K越小，受試化合物的蓄積毒性越大。K蓄積作用強度＜1高度蓄積1~3明顯蓄積3~5中度蓄積＞5輕度蓄積1．固定劑量法：固定每天染毒劑量為1/20—1/5LD50，連續染毒，直至試驗動物半數死亡。假如染毒劑量累計已達5個LD50動物死亡仍末達半數，試驗均可告結束，計算蓄積系數，作出評價。2．遞增劑量法：先測定LD50（1），然后對另一組動物每天染毒，以4天為一期，起先賜予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數死亡，或試驗已達28天，可結束試驗，計算系數。3.二十天試驗法：選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20LD50分別對每組進行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動物有死亡，且有劑量—反應關系，則有較強蓄積作用；如1/20LD50組無死亡，則為弱蓄積。蓄積系數的測定二、亞慢性毒性作用及其試驗方法：1、目的：確定化學物亞慢性毒性的閾劑量和NOEL。2、試驗期限：3-6月；呼吸道吸取：30-90天；皮膚毒性：30天。3、試驗動物的選擇、飼養環境及染毒途徑：試驗動物選擇：對受試化學物敏感的物種或品系；環境：養分合理，飲水清潔、足夠、溫、光、濕適宜；染毒途徑：盡量模擬人類在環境中接觸受試化學物的途徑，與急性毒性試驗相像。4、劑量選擇與分組劑量：1／80—I／50LD50，對于在體內不產生蓄積作用而排泄又快的物質可適當加大劑量，反之則可削減劑量。設3—4個試驗組和1個比照組。試驗組要求：在試驗結束時最低劑量組不產生可視察到的毒性反應；最高劑量組能引起明顯毒性反應，但不引起死亡；中間劑量組產生稍微毒性反應。5、癥狀視察一般性指標(非特異)①一般綜合性指標：動物體重增長率、食物消耗率、活動實力等。②一般化驗性指標：主要指血和肝、腎功能的檢測。(2)特異指標：測定特異性反應。更準確闡明該物質的閾劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。(3)病理組織學檢查：試驗中死亡動物的病理檢查及試驗結束時的尸檢。三、慢性毒性作用及其試驗方法1、目的：評價化學物在長期小劑量作用的條件下對機體產生的損害及其特點．確定閾劑量和最大無作用劑量。2、試驗方法：（1）動物選擇、染毒方法、視察指標等與亞慢性毒性試驗相像；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組：3個染毒組和一個比照組。高劑量組：1/5—1/2亞慢性試驗閾值；中間劑量：1/50—1/10；低劑量組：1/100。第四節致突變試驗一、目的確定外源化學物對生物體是否具有致突變作用。基因點突變試驗、染色體畸變試驗、DNA損傷試驗。二、供試生物：微生物、動物細胞、昆蟲、動物或植物三、試驗方法體外基因突變試驗、細胞遺傳學試驗、體內基因突變試驗、DNA損傷試驗（一）體外基因突變試驗1、Ames試驗（鼠傷寒沙門氏菌/動物肝細胞微粒體試驗）

（1）原理：利用一種突變微生物菌株與被檢測化學物接觸，使突變型微生物回復突變，重新成為野生型微生物。突變型微生物不具備合成組氨酸的實力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培育基上生長。（2）方法：將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培育基上培育,以其生長狀況作為指標。在培育基中加入哺乳動物的肝細胞微粒體：提高靈敏度。（3）特點：優點：簡便、靈敏、快速（48h）、費用低；檢測結果與對動物的致癌性的相符率達約90%。

缺點：利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動物的遺傳信息，僅1/6；微生物的DNA修復系統與動物有差異；微生物無免疫功能。

2、哺乳動物體細胞突變試驗（1）方法原理與微生物突變類似。

常用的細胞株：中國地鼠肺細胞V79中國地鼠肺卵巢細胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株。V79、CHO細胞株正常細胞：缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT，不能在加入類嘌呤堿類物質的培育基上生長；突變細胞：可在加入類嘌呤堿類物質的培育基上生長。L5178Y突變細胞株正常細胞：缺乏胸苷激酶（TK），不行在含有細胞毒物5-溴脫氧尿苷的培育基上生長。突變細胞：可在此種培育基上生長。（二）細胞遺傳學試驗染色體畸變試驗：干脆在顯微鏡下視察染色體結構和數目的變更狀況。生殖細胞或體細胞、體外或體內試驗。體外：CHO細胞:分裂快、數目適中、形態清晰；人類外周血淋巴細胞體內：受試動物骨髓細胞或其他（胸腺、脾、精原細胞）染色體畸變率的變更。（1）試驗方法：a.體外培育：CHO細胞或人類外周血淋巴細胞與化學物，在細胞培育液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培育24h(CHO)或72h(人類細胞）。視察前2h加入秋水仙堿（中期分裂阻斷劑），制片，鏡檢視察。b.體內染色體畸變分析：大鼠、小鼠，染毒飼養，視察骨髓細胞染色體畸變狀況。第四節環境流行病學方法一、概念和特點：流行病學：探討特定人群中有關健康的狀態和事務的分布以及影響這些分布的確定因素；環境流行病學：應用流行病學的原理和方法，重點探討人們在生活和工作環境中各種因素與人群健康的關系。一般流行病學探討的內容是疾病在人群中的分布，它要回答三個問題：(1)疾病在時間、地點、不同人群中是怎樣分布的?(2)什么因素是該病的主要確定因素?(3)怎樣限制該病的流行?環境流行病學除了上述一般內容，還有它本身的特點。(1)它不僅探討疾病的分布規律，而且更常常地探討疾病前的狀態，即包括無異樣〔健康)、微弱的功能變更、疾病的前期(亞臨床狀態)等各種健康狀況，揭示環境污染或某些微量元素的健康效應。(2)環境流行病學探討的暴露因素主要是理化因素。①已知暴露因素，探討其對健康的影響；環境毒理學工作者所進行的大量工作就屬于這種。例如金屬冶煉廠鉛污染大氣對居民健康影響，磷肥廠氟污染大氣對居民健康影響的調查等。②出現健康異樣，追究引起異樣的暴露因素，這屬于探討病因的探討。例如，近年來我國學者對于鼻咽癌、食道癌病因的探討，對克山病、大骨節病病因的探討，均屬于此種類型。日本的水誤病和痛痛病的病因是重金屬污染造成的公害病領域里的探討成果，影響深遠。(3)環境流行病學探討的最終日的是為消退污染、改造環境、愛護居民健康服務。(4)干脆以人群為探討對象，探討結果最具有勸服