2023/2/251實驗動物與動物實驗——第1講

急性毒性試驗№1.Acutetoxicitytest

2023/2/252第一節

概念和意義一、基本概念急性毒性：指24h內單次或多次大劑量給予某藥物所出現的有害作用，亦即快速而劇烈的中毒反應。急性毒性試驗：以觀察急性毒性為目的而設計的一種毒理學試驗，急性毒性試驗以闡明藥物的劑量-毒效關系為出發點，為全面毒性試驗打下基礎。2023/2/253內容定性———毒性反應出現和消失時間、可能的靶器官和死亡原因等；定量———致死量、最大給藥量、半數致死量等。目的和意義測定LD50及相關參數，初步估計毒性大小；觀察急性中毒癥狀，推測毒性靶器官；為長期毒性試驗和特殊毒性試驗的劑量設計提供參考；為早期判斷研發價值提供資料。二、急性毒性試驗的內容、目的和意義2023/2/254三、LD50的測定及統計學原理LD50的概念

1）能引起一群實驗動物50%死亡所需的劑量，2）是某藥物預期引起50%死亡的統計學劑量。

是一個有置信限估計的中介值，

是反映藥物毒效應的上限指標，是藥物急性毒性分級依據。2023/2/255LD50

值的作用及意義LD50是藥物的特征性參數之一，用來判斷毒性程度。有助于計算毒性參數。

急性毒作用帶（Zac）；治療指數TI（LD50/ED50）；安全指數SI（LD5/ED5）；可靠安全系數CSF（LD1/ED99）。Zac=LD50Limac以LD50與急性毒性最小有作用劑量(閾劑量，Limac)的比值來表示（是藥物毒性上限指標與下限指標的比值）。(1)急性毒作用帶（Zac）

Zac大小反應了急性毒性閾劑量與LD50的距離，越大，說明藥物引起死亡的危險性越小；越小，則引起死亡的危險性越大。

TI=半數致死量（LD50）半數有效量（ED50）

TI是指半數致死量與半數有效量之比值。（2）治療指數（Therapeuticindex,TI）

TI值越大,越安全

,一般認為TI大于3的藥物才可能具有實用意義。

目前用于臨床的藥物,其TI值大多大于10。SI=LD5ED95SI是指基本無害量與基本有效量之比值。（3）安全指數（Safetyindex，SI）

SI值可以說明藥物的臨床安全性，但該值往往難以精確計算出來，測定誤差很大。2023/2/259CSF=LD1ED99CSF是指肯定無害量與肯定有效量之比值。（4）可靠安全系數（Certainsafetyfactor，CSF）

CSF值可以說明藥物的臨床安全性，CSF越大，越安全。毒性分級大鼠一次經口LD50(mg·kg體重-1)6只大鼠吸入4小時,死亡2-4只的濃度(ppm)兔經皮LD50(mg·kg體重-1)對人可能致死的估計量g·kg體重-1g·60kg體重-1劇毒﹤1﹤10﹤5﹤0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250微毒5000~10000~2180~﹥15﹥1000表1-1化學異物急性毒性分級（WHO）

小鼠LD50（mg/kg體重）口服皮下注射靜脈或腹腔注射毒藥﹤30﹤20﹤10劇藥﹤300﹤200﹤100普通藥﹥300﹥200﹥100表1-2毒藥、劇藥按LD50值的劃分藥物急性毒性分級2023/2/2511LD50

絕非判斷藥物急性毒性的惟一指標僅是一個統計學術語是許多反映藥物急性毒性的參數之一。急性毒性作用具有比LD50更為深刻的內涵，劑量-效應（死亡）曲線的斜率比LD50

更有價值甚至更為關鍵。LD50

及相關參數的缺陷2023/2/2512動物消耗量大,獲得的信息有限；影響LD50值的因素較多，比如動物的種類、品系、年齡、性別、健康狀況等；從安全性評價角度來講，需要的不是精確的LD50值，而是更多的毒性信息。LD50

測定的明顯不足2023/2/2513四、非致死性毒性反應及其轉歸

非致死性（毒性）反應：試驗中有些動物幸免于致死，但存在不可逆的損傷。非致死性有害反應與致死性反應僅僅是程度上的差異，都是用藥過程中不希望出現的。非致死性毒性反應的轉歸——是否可逆反應是否可逆主要取決于:

●

毒性作用涉及的器官與系統

●

藥物的內在毒性

●

用藥時間的長短

●

在確定的時間范圍內，藥物在體內的量

●

動物的年齡和健康狀況如在動物中觀察到不可逆反應，則應注意外推至人時是否存在。2023/2/2515第二節

試驗設計及方法一、基本要求兩種動物小動物—LD50、最大耐受量試驗大動物—單次給藥的近似致死量和最大耐受量兩種給藥途徑—其中一種必須與臨床用藥途徑相同試驗周期—7-14天LD50計算方法—Bliss法必要時可增加一個溶媒對照組實驗條件及方法必須規范化表1-3各國對急性毒性試驗的基本要求FDA日本美國英國前西德歐盟俄羅斯WHO瑞士動物種類3-4

2

3

2

2

2

2

3

2給藥途徑

1

3

3

2

2

2

2

3

22023/2/2517二、實驗動物

動物選擇的原則：●

盡量選擇急性毒性反應與人近似的動物；●

易于飼養管理、試驗操作方便的動物；●

繁殖生育力較強，數量較大能夠保障供應；●

價格較低，易于獲得的動物。2023/2/2518二、實驗動物

在基礎性研究工作中按科研課題的具體要求選擇，在法規性毒理學評價工作中，必須按照其規范要求進行。無論使用何種動物都必須注明動物的來源、品系、年齡、體重、性別、飼養條件以及動物生產合格證書。如系無特殊病原體動物也應在報告中注明。2023/2/2519二、實驗動物

種類小鼠、大鼠、犬、猴、家兔（經口給藥不用）下列情況考慮選用非嚙齒類動物大鼠、小鼠LD50差別明顯；藥物藥動學在嚙齒類與非嚙齒類之間存在明顯差異；為了得到明確的毒效表現，初步了解藥物的特性后，在條件許可的情況下可考慮選用其他敏感動物。2023/2/2520二、實驗動物

健康狀況：健康動物體重與年齡同一批實驗中，動物的年齡、體重應盡可能一致；原則上選用年輕成年動物，嚙齒類動物的年齡一般為7~9周齡，非嚙齒類動物起始為6~8月齡；同一批試驗中，動物的初始體重變異要求不超過平均體重的±20%。(同一組最大組與最小組差異不得超過20%、組間變異不應超過10%）表1-4常用實驗動物的生活年限及體重選擇動物生活年成年體重選擇范圍（g）種類限（年）時間(月)體重(g)急性實驗長期性實驗小鼠1.5~221518~2515~18大鼠2~2.53150150~24050~100豚鼠6~82250200~250150~200家兔4~93~415001500~20001200~1500狗10~203~4-8000~150004000~60002023/2/2522二、實驗動物

性別急性毒性試驗中應考慮雌雄動物數目相等；但在試驗中如發現某性別動物的死亡率明顯高于另一性別時，則最好對該性別的LD50

另外計算，或考慮選用敏感性別的動物重新進行急性毒性試驗。2023/2/2523二、實驗動物

動物分組方法動物應隨機分配至各劑量組；隨機分組可使動物形成一個均勻的整體，并可減少因個體差異而造成的誤差;體重或健康狀況不符合要求的動物應在隨機分組前剔除。隨機分組按體重分區組：≤18g、18～20g、20～22g、22～24g、24～26g、≥26g.再將這7組分入各組中。2023/2/2524二、實驗動物

動物給藥前禁食處理經口途徑染毒，在試驗前應作禁食處理。大鼠主要在夜間進食，要求染毒前應隔夜禁食。小鼠由于其消化吸收和代謝速度較快，可隔夜禁食也可禁食4小時以上。大動物常前一天正常給食，染毒前不喂食即可。禁食期間均正常給水。染毒2小時后提供飼料。經口多次染毒，可不禁食。2023/2/2525三、劑量水平的選擇劑量水平的選擇以測定LD50及劑量-反應曲線的斜率為目的（10%-50%-90%）；4上以上劑量，至少有3個落在10%-90%之間；做預試驗來摸索劑量通過文獻檢索，為已知化學類別的藥物確定預期毒性中值；對全新結構的藥物或中草藥復方，可先通過小批量動物摸索，找出Dmin和Dmax。2023/2/2526▲

已知結構的藥物——確定預期毒性中值

對于己了解化學結構的藥物，在確定其所屬化學類別及其所含的特殊基團的基礎上，查閱有關文獻，找出與藥物結構近似或有共性基團的藥物的毒性資料；其次最好能了解藥物的理化性質，最后綜合考慮這兩方面的資料，選擇與藥物的化學結構和理化性質最為接近的己知藥物的LD50

作為藥物的預期毒性中值。理論依據：構效關系2023/2/2527確定預期毒性中值（LD50）后，以此值為中間劑量，再以該中間劑量值為基準，按一定的組間距上下各推二個劑量，作為預試驗的劑量分組。

預試時，組間距可稍大些，i

值可取0.6，相鄰劑量比為1:4。如果估計藥物的致死劑量范圍較窄，組間距可適當縮小，i

值取0.2，相鄰劑量比為1:1.6。組間距i

值，劑量的對數值等差分布，劑量等比分布▲

已知結構的藥物——確定預期毒性中值通過預試找出藥物使10%-90%實驗動物死亡劑量的大致范圍,再據此確定正式試驗的具體分組方案,此時可按下式求算組間距（i

值）。

或

i

=logLD90-logLD10n-1

i

=logLD100-logLD0n-1▲

已知結構的藥物——確定預期毒性中值2023/2/2529▲

全新結構藥物或中草藥復方——確定極值

先通過小批量動物的摸索，找出0%及100%估計致死量(即Dmin和Dmax)，再求出

i值。

(1)用10倍稀釋的藥物濃度系列，用少量動物（每組2-3只），找出大致死亡范圍。

劑量死亡數/動物數5mg/kg

0/250mg/kg1/2

500mg/kg2/25000mg/kg2/2上述結果提示

,大致死亡范圍為50mg/kg-500mg/kg。(2)再用1、2、4、8………等2

倍稀釋的藥物濃度每組4只動物實驗，找出Dmin和Dmax。▲

全新結構藥物或中草藥復方——確定極值當出現4/4死亡時，如其前一組為3/4死亡，則取4/4組的劑量為Dmax，如前一組為2/4或1/4死亡(如本例為2/4)，考慮到4/4組的劑量在正式實驗中可能的死亡率低于70%，為慎重起見，可將4/4組的劑量乘以2作為Dmax；當出現0/4死亡時，如其后一組的死亡率為1/4，則取0/4組的劑量為Dmin，如后一組死亡率大于1/4，考慮到0/4組的劑量在正式實驗中可能的死亡率高于70%，則將0/4組的劑量除以2，作為Dmin。

劑量死亡數/動物數

50mg/kg0/4*

100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4Dmin=50÷70%÷2≈35（mg/kg）Dmax

=

400×70%×2

=

560（mg/kg）

劑量死亡數/動物數

50mg/kg0/4*

100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4Dmax：當出現4/4死亡時,如前一組死亡率為2/4時Dmax=4/4死亡劑量×1.4()=400×1.4=560（mg/kg）Dmin：當出現0/4死亡時，如后一組死亡率大于1/4Dmin=0/4死亡劑量÷1.4()=50÷1.4≈35（mg/kg）陳奇：《中藥藥理研究方法學》第3版在確定了Dmax和Dmin以后，可求得組間距（i值):以Dmin的對數為起點，向上推出n

組動物的各組劑量的對數值，求出反對數即可求得各組的劑量。

i

=logDmax-logDminn-1求組間距（i值):2023/2/2533四、劑量組數及動物數LD50

測定中劑量組數的設計，除符合統計學要求外，還應根據預試驗所提供的藥物的毒性情況而定；一般而言，在實際工作中設4~5個劑量組，劑距以0.65~0.85為宜；小鼠每組10只(雌雄各半)，大鼠不應少于6~8只。2023/2/2534五、劑型與給藥應寫明受試藥物的名稱、批號、來源、純度、保存條件及配制方法。供試藥品應能溶于或混懸于適當的溶媒，如果溶媒的毒性情況是未知的，則應設立一個溶媒對照組，溶媒對照組的給藥容量應與最高劑量組相等。對所用溶媒及助溶劑須有詳細記錄，以備分析和審核。給藥途徑要用2種，其中應包括推薦臨床研究的給藥途徑。溶于水的藥物應當測定靜脈給藥途徑的急性毒性，口服藥物應灌胃給藥。藥物可以等體積（各劑量組的藥物濃度不同）或等濃度（各劑量組的給藥體積不同）給藥，但必須注意上述兩種方式給藥所觀察到的毒性效應可能是不盡相同的。2023/2/2535五、劑型與給藥給藥的體積，嚙齒類動物口服給藥的最大的體積，對非水溶液而言以不超過10ml/kg為宜，水溶液或混懸液一般不超過20ml/kg。如果劑量較大而不便于一次給藥，可以分成相等的容量，每隔6~8小時給藥，但必須在第一次給藥后的24小時內完成。口服給藥應禁食；靜注給藥應注意藥液的pH值、溫度、滲透壓、注射速度等可能影響毒效應的各種因素。動物給藥途徑常用容量最大容量小鼠ig0.2ml/20g1.0ml/20giv0.2ml/20g0.5ml/20gip0.2ml/20g1.0ml/20gsc0.1ml/20g0.5ml/20gim0.1ml/20g0.2ml/20g表1-6急性毒性試驗常用動物單次給藥的常用容量和最大容量大鼠ig

1.0ml/200g

3.0ml/200giv

0.5ml/200g

1.0ml/200gip

1.0ml/200g

3.0ml/200gsc

0.5ml/200g

1.0ml/200g狗im

0.2ml/200g

0.5ml/200gig

10ml/只

20ml/只iv

35ml/只

50ml/只2023/2/2537六、試驗時限與量限

急性毒性試驗的觀察時間取決于癥狀出現的時間、毒性強弱、致死速度、恢復速率以及藥物本身的代謝特征等。我國新藥審批辦法規定：急性毒性試驗必須觀察7~14d，但一般不必超過2wk（14d）。在表示藥物的LD50

時最好同時注明觀察時間，這樣在毒性比較時，才會有共同的基礎。在實際工作中，對于毒性低的藥物可用最大給藥濃度和最大給藥容量單次或24h內分次給藥，一般使用20只嚙齒類動物，連續觀察7~14d，如無死亡出現，則該劑量即為藥物的最大耐受劑量。藥液配制的具體步驟：等比稀釋溶液：各小鼠給藥容積一樣=0.1ml/10g預試中Dm=344mg/kg，Dn=141mg/kg，算出r=1.25，小鼠的平均體重為20g，每組10只，用藥量為0.1ml/10g=10ml/kgC1=344mg/kg/10ml/kg=34.4mg/ml每組藥液量=每組動物總重×用藥量=200g×0.1ml/10g=2ml1號2號3號4號5號1號液2號液3號液4號液5號液2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2023/2/2539七、觀察指標目的：找出毒性作用的特征，初步獲得藥物毒效應的靶器官和受試動物的死亡原因。內容：

籠邊觀察

特別要注意給藥后６h內動物中毒癥狀及死亡情況。觀察的時間間隔及頻度必須根據癥狀出現、恢復、變化及死亡時間而定，一般給藥后持續觀察30min，第1~

4h再觀察1次，以后每天觀察1次。2023/2/2540中毒部位毒性癥狀表現中樞神經及運動神經系統自發活動減少或增加，嗜睡，翻正反射消失，舔毛，噪動，僵持，震顫，驚厥，共濟失調，異常運動等植物神經系統瞳孔放大或縮小，腺體分泌增加，流涎，豎毛，共濟失調，肌張力增強或減弱呼吸系統鼻孔分泌物，呼吸急促，呼吸緩慢，腹式呼吸，喘息，窒息，紫紺等心血管系統心動過速，心動過緩，血管擴張或收縮，心輸出改變，心律失常等胃腸道系統糞便堅硬，干燥，量少，便秘，腹瀉，水樣便，嘔吐，惡心，干嘔等泌尿系統血尿，多尿等眼睛流淚，眼球突出，上瞼下垂，血性淚液，眨眼（瞬膜反射），角膜渾濁，虹膜炎，結膜炎等皮膚、被毛水腫，發紅，皮疹，炎癥，被毛豎立，色黃等表1-7急性毒性試驗中的一般毒性癥狀觀察

2023/2/2541七、觀察指標死亡過程與死亡時間

藥物的毒效應是不同的，毒性作用（反應）出現的先后次序以及是否出現都可體現毒效應的差異。致死所需的時間和所需的劑量都是衡量藥物毒性強弱的依據。

死亡時間也可間接地反映藥物毒作用性質的信息。2023/2/2542七、觀察指標體重

給藥前、給藥期間（每天或根據需要確定間隔）、動物死亡時及實驗終止時必須對每個動物進行稱重，觀察藥物對動物體重的影響。

引起體重減輕或增長率減慢的原因較為復雜因此，體重的變化要在全面觀察的基礎上仔細地加以分析。2023/2/2543七、觀察指標

尸體解剖及病理組織學檢查

對于瀕死的或己死亡的動物以及實驗終止時尚存活的動物必須進行系統的尸體解剖檢查。

病理組織學檢查并非必要的檢查項目。但是對于遲發死亡動物，尤其是發生“雙峰”死亡現象時，應進行病理組織學檢查，以便為死因的確認提供依據。觀察記錄應盡量準確、具體、完整。不單記錄死亡時間，還應記錄具體的中毒表現，并應能表明出現的時間及持續的時間。2023/2/2544第三節

LD50計算方法一、孫氏改進寇氏法（點斜法）二、Bliss法2023/2/25451.基本要求反應情況應符合或接近對數正態分布；相鄰兩劑量的比值應相等；各組動物數相等或相近，一般為10只；不要求死亡率一定包括0%與100%，但二者之和最好在80%~120%范圍內。一、孫氏改進寇氏法（點斜法）2023/2/25462.計算公式

(1)當最小劑量組的死亡率為0

%,最大劑量組的死亡率為100%時，按下列公式計算：LD50=lg-1[Xm–i(∑P

-

0.5)]

…(1)

式中Xm

為最大劑量的對數；

p

為各組動物的死亡率(以小數表示)；

∑P為各組動物死亡率的總和(P1

十P２

+P3

……

)

i

為組間距(相鄰兩組對數劑量的差值)。一、孫氏改進寇氏法（點斜法）2023/2/25472.計算公式

（2）當最小劑量組的死亡率大于0%而又小于30%，或最大劑量組的死亡率小于100%而又大于70%時：

式中Pm

為最大劑量組的死亡率;

Pn

為最小劑量組的死亡率。一、孫氏改進寇氏法（點斜法）LD50=

lg-1[Xm-i(

∑P-3–Pm-Pn)]

…(2)42023/2/25482.計算公式

（3）LD50

的標準誤差按下式計算:

式中Sx50

為lgLD50的標準誤差；

X50即lgLD50；

n為每組動物數。一、孫氏改進寇氏法（點斜法）Sx50=i·(∑P-∑P2)

…(3)n-12023/2/25492.計算公式

（4）LD50的95%可信限按下式計算

一、孫氏改進寇氏法（點斜法）

95%可信限=

lg-1

(

X50±1.96Sx50

)…(4)2023/2/2550例題

取體重18-22g小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只，按表1-8中劑量腹腔注射PAM溶液，組間劑量比為1:0.8，死亡率見表1-8，用改良寇氏法計算其半數致死量、標準誤差和95%可信區間。

2023/2/2551按式（1）計算LD50

現Xm=2.48，i=0.10，∑P=2.6LD50=lg-1[Xm–i(∑P-0.5)]=lg-1[2.48–0.1(2.6-0.5)]=lg-12.27=186.21mg/kg2023/2/2552按式(3)計算LD50

的標準誤差

現n=10，∑P2=1.98

Sx50=i·

(∑P-∑P2)n-1=

0.10·

2.6–1.9810-1=0.0069

2023/2/2553按式(4)計算LD50

的95%可信限95%可信限=

lg-1

(

X50

士1.96

Sx50

)

=lg-1

(

lg186.21

士1.96

×0.0069)=lg-1

(2.27

士0.0135)=lg-1

(2.2565~2.2835)=180.51~192.09mg/kg答：PAM對小鼠腹腔注射的LD