經典總RNA的提取和RTPCR第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日完整RNA的提取和純化,是進行RNA方面的研究工作如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。掌握從細胞中提取總RNA的方法掌握RT-PCR基因擴增的原理和操作方法目的第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗流程提取原理操作步驟逆轉錄原理操作步驟提取總RNA合成cDNA第一鏈原理體系引物選擇PCR電泳原理電泳步驟電泳第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一部分

細胞總RNA的提取第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日操作步驟

1.勻漿化作用

8000rpm離心2min收集細胞，棄上清；加入500uL的TRIpure,用振蕩器震蕩至無明顯沉淀,室溫靜置5min.2.分離階段向勻漿樣品中加入0.1mL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫下孵育2-3min，12000g離心15min，吸取上清至新Ep管。3.RNA的沉淀向上清中加入0.5mL異丙醇，上下顛倒混勻,室溫孵育10min，12000g離心10min，棄去上清液，可見膠狀沉淀。4.RNA的漂洗加500微升75％乙醇洗滌沉淀一次，輕輕上下顛倒洗滌，12000g離心5min,棄去乙醇.5.RNA的再溶解空氣干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uLRNase-Free處理水，充分溶解。第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日原理10-5mgRNA/細胞

mRNA3’端存在20-250個多聚腺苷酸(polyA)結構，可用oligo(dT)親和層析柱分離mRNA。RNA分離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，鹽酸胍-有機溶劑法，氯化鋰-尿素法，蛋白酶K-細胞質RNA提取法等、異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。rRNA80-85%：28S18S5StRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日原理：Trizol的主要成分Trizol是一種新型總RNA抽提試劑主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質，其主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白/核酸物質解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase。第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA在上層水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質。原理第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日儀器和主要試劑1.微量加樣槍、滅菌超薄PCR反應管2.TRIpure試劑3.氯仿4.異丙醇5.75℅乙醇6.無RNase的水(溶液均需用DEPC處理過的水配制)第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關鍵點：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。關鍵點第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日RNA酶污染來源RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。嚴格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。最大限度地抑制內源性的RNA酶：而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日防止RNA酶污染的措施

所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時間。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。配制的溶液應盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經濾膜過濾除菌。操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日RNA完整性檢測完整的RNA的電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，并且28S大約是18S的兩倍寬。若兩條帶不明顯,則說明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日RNA降解

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。C.細胞在用胰酶處理時過度。D.溶液或離心管未經RNase去除處理。E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染A.樣品勻漿時加的試劑量太少B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇，DMSO等)，強緩沖液或堿性溶液常見問題分析第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二部分

逆轉錄-聚合酶鏈反應

(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日儀器和主要試劑基因擴增儀、微量加樣槍、滅菌超薄PCR反應管總RNA第一鏈cDNA合成試劑盒（含有逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液）dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/LTaqDNA聚合酶第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日操作步驟采用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit

合成cDNA第一鏈按下列組分配制RT反應液RT-Mix（包括反轉錄酶和反應緩沖液）2.5uL引物（包括OligodTPrimer，50uM；Random6mers,100uM

)2.5uLTotalRNA5uL反轉錄反應條件如下37℃15min（反轉錄反應）85℃5sec（反轉錄酶失活反應）注：反轉錄步驟在PCR儀中進行第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日取0.2mlPCR反應管一只，用微量加樣槍分別加入各試劑：

PCR反應體系rTaq

Mix

25uLcDNA第一鏈產物5uL引物（正、反向引物各10uM)各2uLH2Oupto50ulPCR反應條件如下94℃2min;

[94℃30sec;55℃30sec；72℃30min]----30循環(huán)72℃7min4℃保溫第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。原理第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日RT-PCR-逆轉錄-聚合酶鏈反應

逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。在長時間的逆轉錄過程中，不會造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長的cDNA鏈的合成。禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。MMLV反轉錄酶的RNaseH-突變體：商品名為Superscript和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。反轉錄酶的選擇

第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日隨機六聚體引物：用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。特異性引物：是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。引物的選擇

第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日PCR反應系統(tǒng)的組成模板引物

dNTP

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）緩沖液第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日（一）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日(二)引物引物的設計：使用引物設計軟件NTI9.0,PRIME5.0等長度一般最低不少于16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為18～21個核苷酸。有時可在5’端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點等，以完成基因克隆和其它特殊需要。兩個引物之間不應發(fā)生互補，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補堿基也不應大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primerdimer）。引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是發(fā)夾結構（hairpinstructures）。(G+C）%含量:引物的組成應均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G+C）%含量應盡量相似。引物的合成：找專門的生物公司進行引物合成第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日引物的特異性：引物的設計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用引物的濃度：引物量太低，則產物量降低，會出現假陰性引物濃度過高會促進引物的錯誤引導非特異產物合成，還會增加引物二聚體的形成一般認為PCR反應中引物的終濃度為0.2～1μmol/l為宜第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日（三）Taq酶從水生棲熱菌ThermusAquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶酶濃度：酶的濃度太低會使擴增產物產量降低，如果酶的濃度太高則會出現非特異性擴增每100μl反應液中含1-2.5uTaqDNA聚合酶為佳保存：-20℃，避免反復凍存第二十八頁，共