質粒DNA提取純化、DNA電泳檢測一、 實驗目的?掌握質粒DNA的制備的原理和方法.了解質粒瓊脂糖凝膠電泳分離二、 實驗原理?質粒DNA的制備方法質粒(Plasmid)是獨立存在于染色體外、能自主復制并能穩定遺傳的一種環狀雙鏈DNA分子，分布于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，但在細菌細胞中含量最多。細菌質粒大小介于1~200Kb之間，是應用最多的質粒類群，在細菌細胞內它們利用宿主細胞的復制機構合成質粒自身的DNA。質粒DNA的制備包括3個步驟：①培養細菌，使質粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS;煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS,—般用于質粒大量提取。在實際操作中可以根據宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒DNA的用途進行選擇。本實驗選擇堿裂解法提取質粒DNA。.堿裂解法質粒DNA具特定的形態結構，在特殊的環境條件下，如加熱、極端pH值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等會導致質粒DNA變性，去除變性條件又可以使DNA復性。堿裂解法根據共價閉合環狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能裂解細菌細胞，又能使細菌蛋白質變性。SDS處理細菌細胞后會導致細菌細胞壁破裂，從而使質粒DNA及細菌基因組DNA從細胞中同時釋放出來。細菌環狀基因組DNA在操作過程中會斷裂成線狀DNA分子，在pH值介于12.0~12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞結合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀緩沖液時，pH恢復至中性，因為共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網狀結構，而復性的質粒DNA恢復原來構型，保持可溶性狀態。通過離心，就可去除染色體DNA和蛋白質-SDS復合物等物質，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質粒DNA，乙醇或異丙醇沉淀就可得到純的質粒DNA,之后可再用超離心、電泳、離子交換柱層析等方法進一步純化質粒。.質粒瓊脂糖凝膠電泳分離瓊脂糖凝膠電泳技術(agarosegelelectrophoresis)是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子的高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的DNA,也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子，如pUC19質粒，有3種構型：超螺旋的共價閉合環狀質粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)；開環質粒DNA，即共價閉合環狀質粒DNA1條鏈斷裂(opencircularDNA,OCDNA)和線狀質粒DNA，即共價閉合環狀質粒DNA2條鏈發生斷裂(linearDNA,LDNA)。這3種構型的質粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環質粒DNA。三、儀器及試劑儀器及耗材：冷凍離心機、微量移液器、1.5mlEP管、槍頭、凝膠槽、電泳儀等。試劑及配制：溶液1(GET緩沖液)：25mmol/LTris-HC(pH8.0),10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄糖，pH8.0溶液II(變性液)：200mmol/LNaOH,1%SDS配制：1ml 10%SDS50|jl、1NNaOH200pl取以上溶液，用滅菌去離子水定容至1ml,充分混勻，現用現配。溶液III(醋酸鉀液):3mol/L醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH5.6。5mol/L冰醋酸配制：100ml 醋酸鉀29.4g、冰醋酸11.5ml加入60ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至100ml。高溫高壓滅菌后，4°C保存。其它試劑：TE(pH8.0)、飽和酚、酚/氯仿(25:24)、無水乙醇、70%乙醇、電泳緩沖液、6x上樣緩沖液四、實驗步驟接種細菌于LB液體培養基中，37C培養過夜（Ecoli.o]T10,pUC19質粒）；取細菌懸液1mL于1.5mLEP管中，4000rpm/min,離心2min;.棄上清，加入100頁溶液I;加入200頁溶液II,顛倒混勻，靜置2min;加入150頁溶液II，I顛倒混勻，靜置5min;4C， 12000rpm/min，離心10min;取400Ml上清移入另一EP管，加等體積飽和酚，振蕩混勻，12000rpm/min，離心10min;取約300Ml上層水相移入另一EP管，加等體積酚/氯仿，振蕩混勻，12000rpm/min，離心10min;取200頁上層水相移入另一EP管，加2倍體積無水乙醇，混勻置-201.5C小時，沉淀DNA;.12000rpm/min，離心10min，棄上清，加入1mL70%乙醇洗滌DNA沉淀，小心吸棄乙醇；.開蓋放置5min干燥DNA，加入15頁TE溶解DNA;.加入3頁X上樣緩沖液，混勻，18頁分兩次上樣于1%瓊脂糖凝膠電泳;.上樣9〃lDNAmarker。.150V,60min,紫外燈下觀察結果。五、結果與討論.質粒電泳結果質粒DNA在含有漠化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳中，被染成橘黃色。如下圖所示，質粒DNA可以觀察到3條帶，電泳速度最慢的條帶顯色最淺。質粒DNA有3種構型，即共價閉合環狀質粒(cccDNA)、開環質粒(OCDNA)和線狀質粒DNA(LDNA)。在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環質粒DNA。本次實驗的結果中的三條帶，也可推測為：超螺旋質粒DNA、線狀DNA和開環質粒.細菌基因組DNA與質粒DNA分離注意事項在加入細菌裂解液后，需要顛倒混勻，細菌環狀基因組DNA在操作過程中會斷裂成線狀DNA分子。這時應當上下顛倒輕輕混勻，以避免產生小分子量的基因組DNA片斷，最后污染提取的質粒DNA。.漠酚藍指示劑上樣緩沖液中含有漠酚藍（Bromophenolblue,別名四漠苯酚磺