基因工程考點一基因工程的操作工具1．基因工程的概念理解(1)供體：提供目的基因。(2)操作環境：體外。(3)操作水平：分子水平。(4)原理：基因重組。(5)受體：表達目的基因。(6)本質：目的基因在受體體內表達。(7)優點①與雜交育種相比：克服了遠緣雜交不親和的障礙。②與誘變育種相比：定向改造生物遺傳性狀。2．DNA重組技術的基本工具(1)限制性核酸內切酶(簡稱：限制酶)①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。②作用：識別特定的核苷酸序列并切開相應兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。③結果：產生黏性末端或平末端。(2)DNA連接酶①種類：按來源可分為E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。②作用：在兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵以連接兩段DNA片段。(3)載體①種類：質粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。②質粒特點eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(能自我復制,有一個至多個限制酶切割位點,有特殊的標記基因))(1)限制酶與DNA連接酶的關系。提示：①限制酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵。②限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。(2)載體所具備條件的目的性。提示：條件目的性穩定并能復制目的基因穩定存在且數量可擴大有一個至多個限制酶切割位點可攜帶多個或多種外源基因具有特殊的標記基因便于重組DNA的鑒定和選擇(3)幾種酶的比較。提示：比較項目限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脫氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對間的氫鍵模板不需要不需要需要不需要作用結果形成黏性末端或平末端形成重組DNA分子形成新的DNA分子形成單鏈DNA分子題組一考點診斷(1)切割質粒的限制性核酸內切酶均特異性地識別6個核苷酸序列。(2014·高考江蘇卷)()(2)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因。(2014·高考江蘇卷)()(3)限制酶只能用于切割目的基因。()(4)DNA連接酶能將兩堿基間通過形成氫鍵連接起來。()(5)E·coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。()(6)質粒是小型環狀DNA分子，是基因工程常用的載體。()答案：(1)(×)(2)(×)(3)(×)(4)(×)(5)(×)(6)(√)2．下列關于載體的敘述中，錯誤的是()A．載體與目的基因結合后，實質上就是一個重組DNA分子B．對某種限制酶而言，載體最好只有一個切點，但還要有其他多種酶的切點C．目前常用的載體有質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒D．載體具有某些標記基因，便于對其進行切割解析：選D。標記基因的作用是便于篩選出重組載體，不是便于對其切割。3．如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化，圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是()A．①②③④ B．①②④③C．①④②③ D．①④③②解析：選C。限制酶可在特定位點對DNA分子進行切割；DNA聚合酶在DNA分子復制時將脫氧核苷酸連接成脫氧核苷酸鏈；DNA連接酶可將限制酶切開的磷酸二酯鍵連接在一起；解旋酶的作用是將DNA雙鏈解開螺旋，為復制或轉錄提供模板。1.限制酶是一類酶，而不是一種酶。2.限制酶切割位點所處的位置必須是在所需的標記基因之外，這樣才能保證標記基因的完整性，有利于對目的基因的檢測。3.為使目的基因與載體形成相同的DNA片段末端連接，通常使用同一種限制酶將二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所產生的末端也存在互補關系時，則兩末端也可連接。考點二基因工程的操作過程及其應用1．基因工程的操作程序(1)基因工程的操作步驟①eq\x(\a\al(獲取目,的基因))—eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.從基因文庫中獲取,b.利用PCR技術擴增,c.通過化學方法人工合成))②eq\x(\a\al(構建基因,表達載體))—組成eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.目的基因,b.啟動子,c.終止子,d.標記基因))③eq\x(\a\al(將目的基因導,入受體細胞))—方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.植物：農桿菌轉化法、,基因槍法、花粉管通道法,b.動物：顯微注射法,c.微生物：感受態細胞法))④eq\x(\a\al(檢測和,鑒定目,的基因))eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.利用DNA分子雜交法檢測目的基因是否,插入轉基因生物染色體的DNA中,b.利用分子雜交技術檢測目的基因是否轉錄,出相應的mRNA分子,c.利用抗原—抗體雜交技術檢測目的基,因是否已表達出相應的蛋白質,d.有時還需從個體水平對其生物學特定性狀,進行檢測))2．基因工程的應用(1)植物基因工程：主要用于提高農作物的抗逆能力，以及改良農作物的品質和利用植物生產藥物等方面。(2)動物基因工程：主要應用于動物品種改良、建立生物反應器、器官移植等方面。(3)基因工程藥物：來源于轉基因的工程菌。(4)基因治療：把正常基因導入病人體內，使該基因的表達產物發揮功能。[深度思考](1)在目的基因的獲取方法上有怎樣的區別？提示：直接分離法①從自然界已有的物種中分離，如從基因組文庫或cDNA文庫中獲取。②如果需要大量增加目的基因，且目的基因的核苷酸序列僅部分已知，則利用PCR技術擴增。人工合成目的基因①如果基因比較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。②以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下人工合成。(2)基因表達載體的構建。提示：①基因表達載體的組成及作用：②基因表達載體的構建過程：(3)將目的基因導入受體細胞。提示：①轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。②將目的基因導入受體細胞：生物種類植物動物微生物常用方法農桿菌轉化法顯微注射技術感受態細胞法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上→轉入農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→重組表達載體DNA分子與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子(4)目的基因的檢測與鑒定。提示：方法檢測或鑒定目的水平DNA分子雜交技術檢測目的基因的有無分子水平分子雜交技術目的基因是否轉錄抗原—抗體雜交技術目的基因是否翻譯生物性狀的表達與否目的基因是否表達個體水平,題組一考點診斷(1)抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達。(2014·高考江蘇卷)()(2)應用DNA探針技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其完全表達。(2011·高考四川卷)()(3)將人的干擾素基因重組到質粒后導入大腸桿菌，獲得能產生人干擾素的菌株。()(4)利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫藥產品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物的乳腺細胞中。()(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體。()答案：(1)(√)(2)(×)(3)(√)(4)(×)(5)(×)題組二基因工程的操作過程及應用分析1．(2014·高考廣東卷)(多選)利用基因工程技術生產羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如下圖所示，下列敘述正確的是()A．過程①需使用逆轉錄酶B．過程②需使用解旋酶和PCR獲取目的基因C．過程③使用的感受態細胞可用NaCl溶液制備D．過程④可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導入受體細胞解析：選AD。本題考查基因工程。由mRNA獲得DNA的過程是逆轉錄，需要逆轉錄酶，A項正確。過程②表示用PCR擴增目的基因，此過程不需要解旋酶，通過控制溫度達到解旋的目的，B項錯誤。過程③感受態的大腸桿菌是使用CaCl2處理的，C項錯誤。鑒定目的基因是否導入受體細胞，可以采用DNA分子雜交技術，D項正確。2．(2014·高考新課標全國Ⅱ卷)植物甲具有極強的耐旱性，其耐旱性與某個基因有關。若從該植物中獲得該耐旱基因，并將其轉移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列問題：(1)理論上，基因組文庫含有生物的________基因；而cDNA文庫中含有生物的________基因。(2)若要從植物甲中獲得耐旱基因，可首先建立該植物的基因組文庫，再從中________出所需的耐旱基因。(3)將耐旱基因導入農桿菌，并通過農桿菌轉化法將其導入植物________的體細胞中，經過一系列的過程得到再生植株。要確認該耐旱基因是否在再生植株中正確表達，應檢測此再生植株中該基因的________，如果檢測結果呈陽性，再在田間試驗中檢測植株的________是否得到提高。(4)假如用得到的二倍體轉基因耐旱植株自交，子代中耐旱與不耐旱植株的數量比為3∶1時，則可推測該耐旱基因整合到了________________(填“同源染色體的一條上”或“同源染色體的兩條上”)。解析：(1)基因組文庫包含某種生物的全部基因，cDNA文庫又稱為部分基因文庫，含有生物的部分基因。(2)植物甲基因組文庫中有該種植物的全部基因，從中可篩選出耐旱基因。(3)植物乙的耐旱性低，所以植物乙體細胞作為受體細胞；要確定耐旱基因是否正確表達，應檢測該基因的表達產物，對于個體水平的檢測，應在干旱的田間進行試驗，檢測植物乙耐旱性是否得到了提高。(4)將耐旱基因看作A，不耐旱基因看作a，Aa×Aa→耐旱與不耐旱數量比為3∶1，則耐旱基因整合到了同源染色體的一條上。答案：(1)全部部分(2)篩選(3)乙表達產物耐旱性(4)同源染色體的一條上基因工程操作程序易錯點剖析1．基因表達載體≠載體：基因表達載體與載體相比增加了目的基因。2．目的基因的插入位點不是隨意的：基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入啟動子與終止子之間的部位，若目的基因插入啟動子內部，啟動子將失去原功能。3．啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子：啟動子和終止子位于DNA片段上，分別控制轉錄過程的啟動和終止；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯的啟動和終止。4．切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶。如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。5．基因工程操作過程中只有第三步沒有堿基互補配對現象：第一步存在逆轉錄法獲得DNA，第二步存在黏性末端連接現象，第四步存在檢測分子水平雜交。考點三蛋白質工程及其與基因工程的關系1．流程圖寫出流程圖中字母代表的含義：A．轉錄，B.翻譯，C.分子設計，D.多肽鏈，E.預期功能。2．結果：改造了現有蛋白質或制造出新的蛋白質。3．應用：主要集中應用于對現有蛋白質進行改造，改良生物性狀。[深度思考]蛋白質工程與基因工程的關系項目區別與聯系蛋白質工程基因工程區別過程預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定實質定向改造或生產人類所需的蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品結果可生產自然界沒有的蛋白質只能生產自然界已有的蛋白質聯系①蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造題組一蛋白質工程的分析1．(2013·高考廣東卷)從某海洋動物中獲得一基因，其表達產物為一種抗菌性和溶血性均較強的多肽P1。目前在P1的基礎上研發抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物，首先要做的是()A．合成編碼目的肽的DNA片段B．構建含目的肽DNA片段的表達載體C．依據P1氨基酸序列設計多條模擬肽D．篩選出具有優良活性的模擬肽作為目的肽解析：選C。由題中信息“在P1的基礎上研發抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物”可推知本題考查蛋白質工程的相關知識。根據蛋白質工程的基本途徑：從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列(基因)，可推知答案為C。2．(2016·湖南師大附中月考)干擾素是動物體內合成的一種蛋白質，可以用于治療病毒感染和癌癥，但體外保存相當困難，如果將其分子上的一個半胱氨酸變成絲氨酸，就可在－70℃條件下保存半年，請根據以上信息回答下列問題：(1)蛋白質的合成是受基因控制的，因此獲得能夠控制合成“可以保存的干擾素”的基因是生產的關鍵，依據蛋白質工程原理，設計實驗流程，讓動物生產“可以保存的干擾素”。寫出下列方框中相應實驗步驟。①____________________，②____________________，③____________________，④____________________。(2)基因工程與蛋白質工程相比較，基因工程在原則上只能生產__________的蛋白質，不一定符合__________需要。而蛋白質工程是以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過__________或________，對現有蛋白質進行__________，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活需要。(3)蛋白質工程實施的難度很大，原因是蛋白質具有十分復雜的__________結構。解析：蛋白質工程的操作流程是：預期蛋白質的功能→預期蛋白質結構→推測氨基酸序列→確定相對應的脫氧核苷酸序列。基因工程只能生產自然界已存在的蛋白質，而蛋白質工程卻可以生產自然界不存在的蛋白質。蛋白質工程直接操作的對象是基因。答案：(1)預期蛋白質的功能預期的蛋白質結構應有的氨基酸序列相對應的脫氧核苷酸序列(基因)(2)自然界已存在人類生產和生活基因修飾基因合成改造(3)空間(或高級)題組二蛋白質工程與基因工程的關系分析3．(2015·高考全國Ⅱ卷)已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列問題：(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________進行改造。(2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：________。(3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發，通過________和________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。解析：(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質的功能發生了改變，此過程是通過對構成蛋白質的氨基酸的排列順序進行改造，進而改變了蛋白質的結構，從而改變了蛋白質的功能。(2)在蛋白質工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎，對生物體內原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。中心法則的內容如下圖所示：由圖可知，中心法則的全部內容包括：DNA以自身為模板進行的復制，DNA通過轉錄將遺傳信息傳遞給RNA，最后RNA通過翻譯將遺傳信息表達成蛋白質；在某些病毒中RNA可自我復制(如煙草花葉病毒等)，在某些病毒中能以RNA為模板逆轉錄合成DNA(如HIV)，這是對中心法則的補充。(3)蛋白質工程的基本途徑是預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→合成DNA→表達出蛋白質，經過該過程得到的蛋白質，需要對其生物功能進行鑒定，以保證其發揮正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或結構)(2)PP1DNA和RNA(或遺傳物質)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯)(3)設計蛋白質的結構推測氨基酸序列功能1．(2012·高考新課標全國卷)根據基因工程的有關知識，回答下列問題：(1)限制性內切酶切割DNA分子后產生的片段，其末端類型有________和________。(2)質粒運載體用EcoRⅠ切割后產生的片段如下：AATTC……GG……CTTAA為使運載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性內切酶切割，該酶必須具有的特點是_______________________________________________。(3)按其來源不同，基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類，即________DNA連接酶和________DNA連接酶。(4)反轉錄作用的模板是________，產物是________。若要在體外獲得大量反轉錄產物，常采用________技術。(5)基因工程中除質粒外，________和________也可作為運載體。(6)若用重組質粒轉化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是______________________________________________________________________________________________。解析：此題考查基因工程應用的相關知識。(1)DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端兩種類型。(2)為使運載體與目的基因相連，應使二者被切割后產生的末端相同，故用另一種限制酶切割產生的末端必須與EcoRⅠ切割產生的末端相同。(3)根據酶的來源不同，DNA連接酶分為E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。(4)以RNA為模板，合成DNA的過程稱為逆轉錄，若要體外獲得大量DNA分子，可以使用PCR技術。(5)在基因工程中，通常利用質粒作為運載體，另外噬菌體和動植物病毒也可作為運載體。(6)大腸桿菌作為受體細胞時，常用Ca2＋處理，使之成為能吸收周圍環境中DNA分子的感受態細胞。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割產生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產生的相同(其他合理答案也可)(3)大腸桿菌T4(4)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(5)噬菌體動植物病毒(其他合理答案也可)(6)未處理的大腸桿菌吸收質粒(外源DNA)的能力極弱(其他合理答案也可)2．(2015·高考海南卷)在體內，人胰島素基因表達可合成出一條稱為前胰島素原的肽鏈，此肽鏈在內質網中經酶甲切割掉氨基端一段短肽后成為胰島素原，進入高爾基體的胰島素原經酶乙切割去除中間片段C后，產生A、B兩條肽鏈，再經酶丙作用生成由51個氨基酸殘基組成的胰島素。目前，利用基因工程技術可大量生產胰島素。回答下列問題：(1)人體內合成前胰島素原的細胞是________，合成胰高血糖素的細胞是________。(2)可根據胰島素原的氨基酸序列，設計并合成編碼胰島素原的________序列，用該序列與質粒表達載體構建胰島素原基因重組表達載體，再經過細菌轉化、篩選及鑒定，即可建立能穩定合成________的基因工程菌。(3)用胰島素原抗體檢測該工程菌的培養物時，培養液無抗原抗體反應，菌體有抗原抗體反應，則用該工程菌進行工業發酵時，應從________中分離、純化胰島素原。胰島素原經酶處理便可轉變為胰島素。解析：(1)人體合成前胰島素原的細胞是胰島B細胞，合成胰高血糖素的細胞是胰島A細胞。(2)蛋白質工程生產胰島素時，需根據胰島素原的氨基酸序列，設計并合成編碼胰島素原的脫氧核苷酸序列(目的基因)，然后再構建胰島素原基因重組表達載體，導入細菌細胞內，再經過細菌轉化、篩選及鑒定，即可建立能穩定合成胰島素原的工程菌。(3)運用抗原—抗體檢測法檢測胰島素原時，培養液無抗原抗體反應，菌體有抗原抗體反應，故應從菌體中分離、純化胰島素原。答案：(1)胰島B細胞胰島A細胞(2)DNA胰島素原(3)菌體2.在某些深海魚中發現的抗凍蛋白基因afp對提高農作物的抗寒能力有較高的應用價值。如圖所示是獲得轉基因萵苣的技術流程，請據圖回答下列問題：(1)獲取目的基因的主要途徑包括從自然界已有的物種中分離和________。(2)①過程需要的酶有__________________、________。(3)重組質粒除了帶有抗凍蛋白基因afp以外，還必須含有啟動子、終止子和________________，這樣才能構成一個完整的基因表達載體。(4)如果受體細胞C1是土壤農桿菌，則將目的基因導入它的目的是利用農桿菌的________，使目的基因進入受體細胞C2，并將其插入到受體細胞C2中的________上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達，形成轉基因萵苣。經②過程獲得的轉基因萵苣中的目的基因是否表達，在分子水平上可用________法進行檢測，如果出現雜交帶，說明目的基因已經表達蛋白質產品，轉基因萵苣培育成功。解析：(1)獲取目的基因的主要途徑有從自然界已有的物種中分離和人工合成。(2)①過程為基因表達載體的構建過程，需要用到限制性核酸內切酶和DNA連接酶。(3)一個完整的基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因。(4)農桿菌轉化法利用的是農桿菌的轉化作用，將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上，進而使目的基因能夠穩定遺傳和表達。檢測目的基因是否成功表達可采用抗原—抗體雜交法。答案：(1)人工合成(2)限制性核酸內切酶DNA連接酶(3)標記基因(4)轉化作用染色體DNA抗原—抗體雜交3．(2016·濰坊模擬)胰島素可以用于治療糖尿病，但是胰島素被注射入人體后，會堆積在皮下，要經過較長時間才能進入血液，而進入血液的胰島素又容易分解，治療效果受到影響。如圖是用蛋白質工程設計的速效胰島素的生產過程，請據圖回答有關問題：(1)構建新的蛋白質模型是蛋白質工程的關鍵，圖中構建新的胰島素模型的主要依據是________。(2)圖中從新的胰島素模型到新的胰島素基因的基本思路是______________________________________________________________________________________________。(3)新的胰島素基因與載體(質粒)結合過程中需要限制性核酸內切酶和DNA連接酶。已知限制性核酸內切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—。請畫出質粒被限制性核酸內切酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端：________。DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？________(填“是”或“否”)。(4)若將含有新的胰島素基因的表達載體導入植物細胞中，最常用的方法是________。(5)若要利用大腸桿菌生產速效胰島素，需用到的生物工程有________、________和發酵工程。解析：(1)構建新的胰島素模型的主要依據是蛋白質的預期功能。(2)根據蛋白質的預期功能，推測新的胰島素中氨基酸的序列，進而推斷基因中的脫氧核苷酸序列來合成新的胰島素基因。(3)將目的基因導入植物細胞中，最常用的轉化方法是農桿菌轉化法。(4)限制性核酸內切酶識別特定的核苷酸序列，產生特定的黏性末端或平口末端，而DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列卻沒有專一性要求。(5)生產自然界中本來沒有的蛋白質需要用到蛋白質工程、基因工程等技術。答案：(1)蛋白質的預期功能(2)根據新的胰島素中氨基酸的序列，推測出其基因中的脫氧核苷酸序列，然后利用DNA合成儀來合成新的胰島素基因(3)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(—G,—CCTAG))eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(GATCC—,G—))否(4)農桿菌轉化法(5)蛋白質工程基因工程4．(2016·河北唐山一中期中)如圖是從酵母菌獲取某植物需要的某種酶基因的流程，結合所學知識及相關信息回答下列問題：(1)圖中cDNA文庫__________基因組文庫(填“大于”“等于”或者“小于”)。(2)①過程提取的DNA需要__________的切割，B過程是__________。(3)為在短時間內大量獲得目的基因，可用__________擴增的方法。目的基因獲取之后，需要進行________，其組成必須有________________以及標記基因等，此步驟是基因工程的核心。(4)將該目的基因導入某雙子葉植物細胞，常采用的方法是__________，其能否在此植物體內穩定遺傳可以用________技術進行檢測。解析：(1)cDNA文庫小于基因組文庫。(2)提取目的基因需要限制酶，逆轉錄法獲得目的基因需要逆轉錄酶。(3)短時間內大量獲得目的基因，可用PCR技術擴增的方法。基因表達載體的組成必須有目的基因、標記基因、啟動子和終止子，基因表達載體的構建是基因工程的核心。(4)將目的基因導入某雙子葉植物細胞常采用的方法是農桿菌轉化法，目的基因只有整合到植物細胞的染色體上才能在植物體內穩定遺傳，可通過DNA分子雜交的方法對目的基因是否整合到染色體上進行檢測。答案：(1)小于(2)限制酶反轉錄(或逆轉錄)(3)PCR技術基因表達載體的構建啟動子、終止子、目的基因(4)農桿菌轉化法DNA分子雜交6．(2014·高考天津卷)嗜熱土壤芽孢桿菌產生的β－葡萄糖苷酶(BglB)是一種耐熱纖維素酶，為使其在工業生產中更好地應用，開展了利用大腸桿菌表達BglB酶的試驗：(1)PCR擴增bglB基因時，選用__________基因組DNA作模板。(2)右圖為質粒限制酶酶切圖譜。bglB基因不含圖中限制酶識別序列。為使PCR擴增的bglB基因重組進該質粒，擴增的bglB基因兩端需分別引入________和________不同限制酶的識別序列。注：圖中限制酶的識別序列及切割形成的黏性末端均不相同。(3)大腸桿菌不能降解纖維素，但轉入上述構建好的表達載體后則獲得了降解纖維素的能力，這是因為________________。解析：本題考查了基因工程及影響酶活性的因素。(1)bglB基因存在于嗜熱土壤芽孢桿菌中，所以為擴增bglB基因，應選用嗜熱土壤芽孢桿菌基因組DNA做模板。(2)用限制酶切割時，不能破壞質粒中的復制原點、啟動子、終止子及標記基因(如抗生素抗性基因)，而且要將目的基因插入啟動子和終止子之間，NdeⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ符合條件，而XbaⅠ的酶切位點在質粒中有兩處，這樣會影響目的基因插入的準確性，所以應選擇NdeⅠ和BamHⅠ。目的基因的黏性末端應與質粒相同，所以擴增的bglB基因兩端需分別引入NdeⅠ和BamHⅠ不同限制酶的識別序列。(3)導入目的基因后的大腸桿菌具有分泌BglB酶的能力，即可以降解纖維素。答案：(1)嗜熱土壤芽孢桿菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)轉基因的大腸桿菌分泌出有活性的BglB酶第2講細胞工程[最新考綱]1．植物的組織培養(Ⅱ)2.動物的細胞培養與體細胞克隆(Ⅰ)3.細胞融合與單克隆抗體(Ⅱ)考點一植物細胞工程1．細胞工程(1)操作水平：細胞水平或細胞器水平。(2)目的：按照人的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得細胞產品。2．植物細胞的全能性(1)概念：具有某種生物全部遺傳信息的任何一個細胞，都具有發育成完整生物體的潛能。(2)物質基礎：細胞內含有本物種全部的遺傳信息。(3)體內細胞全能性不表達的原因：基因在特定的時間和空間條件下選擇性表達，形成不同的組織、器官。3．植物組織培養技術(1)原理：細胞的全能性。(2)概念理解eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(培養對象：離體的植物器官、組織、細胞,培養條件：無菌、人工配制的培養基、,相關激素等,培養結果：產生愈傷組織、叢芽，最終形成,完整植株))(3)操作流程；外植體eq\o(→,\s\up7(脫分化))愈傷組織eq\o(→,\s\up7(再分化))根、芽或胚狀體→試管苗。4．植物體細胞雜交技術(1)概念：將不同種的植物體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新的植物體的技術。(2)操作流程：①過程①為去除細胞壁獲得具有活力的原生質體，常用方法是酶解法，所用到的酶是纖維素酶和果膠酶。②過程②是原生質體的融合，人工誘導的物理法包括離心、振動、電激等；化學法一般用聚乙二醇(PEG)作為誘導劑。③過程③是原生質體融合后再生出細胞壁，這是原生質體融合成功的標志。④植物體細胞雜交的意義：克服了遠緣雜交不親和的障礙。5．植物細胞工程的實際應用(1)植物繁殖的新途徑：①微型繁殖：用于快速繁殖優良品種的植物組織培養技術。②作物脫毒：選取作物無毒組織(如莖尖)進行組織培養，獲得脫毒苗的技術。③人工種子：以植物組織培養得到的胚狀體、不定芽、頂芽、腋芽等為材料，經過人工薄膜包裝得到的種子。(2)作物新品種的培育：單倍體育種和突變體的利用。(3)細胞產物的工廠化生產：如人參皂甙干粉的生產。[深度思考](1)植物組織培養和植物體細胞雜交的比較。提示：名稱植物組織培養植物體細胞雜交原理細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性和細胞的全能性過程選材選取根尖、莖尖、形成層部位最容易誘導脫分化不同種的植物細胞的葉片、根尖等部位，也可從組織培養產生的愈傷組織中獲得技術操作脫分化、再分化等除脫分化、再分化外，還要用酶解法去除細胞壁，用一定的方法誘導細胞融合關系植物組織培養是植物體細胞雜交的基礎，植物體細胞雜交所用的技術更復雜(2)植物體細胞雜交獲得的雜種細胞需要篩選嗎？為什么？提示：植物體細胞雜交獲得的雜種細胞的類型有三種(以上圖為例)：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要進行篩選。(3)若一植物細胞含有2X條染色體，2個染色體組，基因型為Aabb，另一植物細胞含有2Y條染色體，2個染色體組，基因型為ccDd，則新植株應為四倍體，其體細胞中染色體數為2X＋2Y，基因型為AabbccDd。題組一考點診斷(1)棉花根尖細胞經誘導形成幼苗能體現細胞全能性。()(2)植物的每個細胞在植物體內和體外都能表現出細胞的全能性。()(3)在誘導離體菊花莖段形成幼苗的過程中，不會發生細胞的增殖和分化。()(4)愈傷組織是外植體通過脫分化和再分化后形成的。()(5)利用物理法或化學法，可以直接將兩個植物細胞進行誘導融合。()(6)用纖維素酶和果膠酶水解獲得的植物原生質體失去了全能性。()(7)再生出細胞壁是原生質體融合成功的標志。()答案：(1)(√)(2)(×)(3)(×)(4)(×)(5)(×)(6)(×)(7)(√)題組二植物組織培養與植物體細胞雜交過程的分析1．某興趣小組擬用組織培養繁殖一種名貴花卉，其技術路線為“取材→消毒→愈傷組織培養→出芽→生根→移栽”。下列有關敘述，錯誤的是()A．消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害B．在愈傷組織培養中加入細胞融合的誘導劑，可獲得染色體加倍的細胞C．出芽是細胞再分化的結果，受基因選擇性表達的調控D．生根時，培養基通常應含α－萘乙酸等生長素類調節劑解析：選B。本題主要考查植物組織培養的相關知識。在愈傷組織中，因植物細胞含有細胞壁，阻礙了細胞融合，所以此時加入細胞融合的誘導劑，不能獲得染色體加倍的細胞；消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害；愈傷組織出芽是細胞分化的結果，而細胞分化的實質是基因的選擇性表達；生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素，生根時，培養基通常含有α－萘乙酸等生長素類調節劑。故B項錯誤。1．細胞全能性大小的比較植物細胞：受精卵>生殖細胞>體細胞動物細胞：受精卵>生殖細胞>胚胎干細胞>體細胞核(動物細胞全能性受限制，但細胞核具有全能性)2．植物激素在植物組織培養中的作用生長素/細胞分裂素的比值作用效果比值高時促進根分化、抑制芽形成比值低時促進芽分化、抑制根形成比值適中促進愈傷組織形成3.由于植物分生區附近(如莖尖)的病毒極少，所以常采用莖尖組織培養技術獲得脫毒苗。考點二動物細胞培養和體細胞克隆1．動物細胞培養(1)操作流程：動物組織塊eq\o(→,\s\up18(剪碎),\s\do15(胰蛋白酶或膠原蛋白酶))單個細胞的懸浮液eq\o(→,\s\up15(轉入培養瓶))原代培養eq\o(→,\s\up13(分瓶))傳代培養(2)培養條件：①無菌、無毒的環境：對培養液和所有培養用具進行無菌處理，添加抗生素，定期更換培養液以消除代謝產物。②營養：除正常的有機和無機營養外，加入血清、血漿等一些天然成分。③適宜的溫度和pH：溫度為36.5±0.5℃(哺乳動物)，pH為7.2～7.4。④氣體環境：含95%空氣加5%CO2的混合氣體，其中后者的作用是維持培養液的pH。(3)應用：生物制品的生產，檢測有毒物質，醫學研究。2．動物體細胞核移植技術和克隆動物(1)動物核移植：將動物一個細胞的細胞核移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發育為動物個體。(2)過程：重組細胞eq\o(→,\s\up13(發育))重組胚胎eq\o(→,\s\up18(胚胎移植))代孕母體→生出與供體遺傳物質基本相同的個體(3)原理：動物體細胞核具有全能性。(4)結果：獲得與供體遺傳物質基本相同的個體。(5)克隆動物：用核移植方法得到的動物。[深度思考](1)動物細胞培養與細胞核移植的比較。提示：項目動物細胞培養動物體細胞核移植原理細胞增殖動物細胞核的全能性關鍵環節細胞增殖和癌變細胞核移植、細胞分化結果相同分化程度的細胞群獲得克隆動物應用①生產生物制品②醫學研究③檢測有毒物質①加速良種繁育②保護瀕危物種③生產醫用蛋白④作為異種移植的供體⑤用于組織器官的移植(2)動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用有什么不同？提示：第一次用胰蛋白酶處理剪碎的組織使之分散成單個細胞，第二次使貼壁細胞從瓶壁上脫落下來。(3)在細胞核移植過程中卵母細胞選擇時期及原因分別是什么？提示：卵母細胞選擇時期及原因：MⅡ中期的卵母細胞，此時具備受精能力，細胞質中合成與分裂、分化有關的物質能刺激融合后重組細胞進行分裂分化，形成重組胚胎。(4)核移植產生的克隆動物與提供細胞核的親本完全相同嗎？提示：可能不同，①克隆動物細胞質基因來源于另一個親本，與植物組織培養不同(來自一個親本)，即克隆動物遺傳物質來自兩個親本。②在發育過程中可能發生基因突變、染色體變異導致性狀改變。③外界環境條件的影響引起不可遺傳的變異。題組一考點診斷(1)在25℃的實驗條件下可順利完成大鼠神經細胞的培養。(2014·高考北京卷)()(2)動物細胞培養技術可用于轉基因動物的培育。(2011·高考江蘇卷)()(3)培養保留接觸抑制的細胞在培養瓶壁上可形成多層細胞。(2010·高考浙江卷)()(4)克隆培養法培養過程中多數細胞的基因型會發生改變。(2010·高考浙江卷)()(5)二倍體細胞的傳代培養次數通常是無限的。(2010·高考浙江卷)()(6)動物細胞核移植的受體細胞必須是卵細胞。()答案：(1)(×)(2)(√)(3)(×)(4)(×)(5)(×)(6)(×)題組二動物細胞培養與體細胞核移植的過程分析1．(2016·江蘇鎮江期末)下列有關動物細胞培養的敘述正確的是()A．動物細胞培養要經過脫分化和再分化過程B．培養基中通常要加入動物血清C．組織細胞分化程度越高，培養越容易D．傳代培養時可用胃蛋白酶分散細胞解析：選B。理解動物細胞培養的過程是解題關鍵。動物細胞培養不需要脫分化；一般來說，組織細胞分化程度越低，增殖能力越強，培養越容易；原代培養和傳代培養時都要用胰蛋白酶把組織細胞分散開。2．科學家通過轉基因技術獲得了含有人生長激素基因的奶牛，如果要加速轉基因奶牛的繁育，可以對此轉基因奶牛進行克隆(如圖所示)。請結合圖示回答下列問題：(1)在進行細胞培養時，要對取自轉基因奶牛的組織細胞進行分散處理，形成單個細胞，這個過程中需要利用________酶處理。(2)用于核移植的供體細胞，一般都選用傳代10代以內的細胞，原因是_______________________________________________。(3)在進行原代培養時，細胞增殖的方式是________，此外，細胞增殖還表現出________和接觸抑制等特點。(4)將進行培養的供體細胞注入去核的卵母細胞中，去除卵母細胞核的目的是_______________________________________________。(5)將重組細胞在培養液中培養形成的重組胚胎移入受體母牛后，該母牛就會生出與供體奶牛遺傳物質相同的犢牛，但也不是100%地復制，原因最可能是______________________________________________________________________________________________。(6)上述動物工程中涉及的技術有_______________________________________________。轉基因牛的克隆成功，說明了動物________具有全能性。答案：(1)胰蛋白(2)該種細胞代謝旺盛、分裂能力強，且遺傳物質沒有發生改變(3)有絲分裂貼壁生長(4)使克隆出的動物個體的遺傳物質幾乎全部來自供體細胞(5)生物的性狀受細胞核基因和細胞質基因的共同控制；生物的性狀還受環境因素的影響(6)核移植、細胞培養、胚胎移植技術體細胞的細胞核1.細胞核移植技術形成重組細胞并發育成一個新個體，體現了細胞核的全能性而非動物細胞的全能性。2.克隆屬于無性繁殖，產生新個體的性別、絕大多數性狀與供核親本一致。考點三動物細胞融合與單克隆抗體的制備1．動物細胞融合(1)原理：細胞膜的流動性。(2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒、電激等。(3)意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能，也為制造單克隆抗體開辟了新途徑。2．單克隆抗體的制備(1)制備過程：(2)優點：特異性強、靈敏度高，并可大量制備。(3)用途：作為診斷試劑，用于治療疾病和運載藥物。[深度思考](1)植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較：提示：比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞膜的流動性、細胞的全能性細胞膜的流動性、細胞的增殖融合前處理除去細胞壁使細胞分散開使用的酶纖維素酶和果膠酶胰蛋白酶誘導手段物理法：離心、電激、振動化學法：聚乙二醇等試劑誘導除物理法和化學法外，也可用滅活的病毒誘導結果雜種植株雜交細胞應用培育植物新品種主要用于制備單克隆抗體意義突破遠緣雜交不親和的障礙，打破了生殖隔離，擴展了雜交的親本組合相同點原生質體融合原理相同，原生質體融合的方法相似(2)單克隆抗體制備過程的幾個問題分析。提示：①對動物免疫的原因：B淋巴細胞要經過免疫過程，即接觸抗原，增殖分化為有特異性免疫功能的B淋巴細胞，才能產生相應的抗體，所以，與骨髓瘤細胞融合的B淋巴細胞實際上是漿細胞。②在單克隆抗體制備過程中，一般認為有兩次篩選過程，第一次是篩選出雜交瘤細胞(用選擇培養基)，第二次是進一步篩選出能產生人們所需要抗體的雜交瘤細胞。③雜交瘤細胞具備雙親的遺傳物質，不僅具有漿細胞產生特異性抗體的能力，還具有骨髓瘤細胞在體外培養條件下大量增殖的能力，從而可以克服單純B淋巴細胞不能無限增殖的缺點，而大量生產單克隆抗體。題組一考點診斷(1)可以用滅活的病毒促進動物細胞融合，而不能促進植物細胞融合。()(2)小鼠骨髓瘤細胞染色體數為40，B淋巴細胞的染色體數為46，融合后形成的雜交瘤細胞DNA分子數為86。()(3)雜交瘤細胞進行體內培養，是為了獲得能產生單克隆抗體的胚胎。()(4)體細胞雜交技術可用于克隆動物和制備單克隆抗體。()(5)B淋巴細胞和骨髓瘤細胞經細胞融合后有三種細胞類型(若僅考慮兩兩融合的情況)。()答案：(1)(√)(2)(×)(3)(×)(4)(×)(5)(√)題組二動物細胞融合與單克隆抗體制備過程的分析1．與植物體細胞雜交相比，動物細胞融合的原理及其特有的誘導因子分別是()A．細胞膜的流動性、離心B．細胞膜的流動性、滅活的病毒C．細胞的全能性、電激D．細胞的全能性、滅活的病毒解析：選B。植物體細胞雜交的原理是細胞膜的流動性、細胞的全能性，動物細胞融合的原理是細胞膜的流動性；動物細胞融合的常用誘導因子有聚乙二醇、滅活的病毒、電激等，其中滅活的病毒是其特有的誘導因子，而聚乙二醇、電激均可用于誘導植物體細胞雜交。制備單克隆抗體過程中的兩次篩選項目第一次篩選第二次篩選篩選原因誘導融合后得到多種雜交細胞，另外還有未融合的細胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經選擇性培養獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞篩選方法用特定的選擇培養基篩選：未融合的細胞和同種細胞融合后形成的細胞(“BB”細胞、“瘤瘤”細胞)都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞(“B瘤”細胞)才能生長用多孔培養皿培養，在每個孔只有一個雜交瘤細胞的情況下開始克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選得到能產生特異性抗體的細胞群篩選目的得到雜交瘤細胞得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞1．(2013·高考新課標全國Ⅱ卷)甲、乙是染色體數目相同的兩種二倍體藥用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小組擬培育同時含有A和B的新型藥用植物。回答下列問題：(1)為了培育該新型藥用植物，可取甲和乙的葉片，先用________酶和________酶去除細胞壁，獲得具有活力的________，再用化學誘導劑誘導二者融合。形成的融合細胞進一步培養形成________組織，然后經過________形成