高級生化與分子生物學技術食品與生物工程學院生物工程教研室主講人：李愛貞杜翠紅azli@第一講分光光度技術1概述2朗白比爾定律3顯色反應4顯色劑5測量誤差及測量條件6紫外-可見分光光度計7分光光度技術的應用非光譜法：

如折射法，濁度法，旋光法不以光的波長為特征訊號，比較有色溶液顏色深淺。光譜法：光學分析法1概述在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質產生的發射光、吸收光或散射光的波長和強度來來鑒別物質或測定其含量的技術。分為：吸光光度法，發射光譜法真空紫外光度法：10～200nm（遠紫外光）紫外吸光光度法：200400nm（近紫外區）

可見吸光光度法：400750nm

紅外光度法：2.51000m4電磁波譜波譜區名稱波長范圍頻率范圍(MHZ)躍進能級類型射線0.005～0.14nm6×1014～2×1012核能級X射線0.0001～10nm3×1014～3×1010

內層電子能級遠紫外光10～200nm3×1010～1.5×109內層電子能級近紫外光200～400nm1.5×109～7.5×108原子及分子的階電子或成鍵電子能級可見光400～750nm7.5×108～4.0×108原子及分子的階電子或成鍵電子能級近紅外光0.75～2.5m4.0×108～1.2×108分子振動能級中紅外光2.5～50m1.2×108～6.0×106分子振動能級遠紅外光50～1000m6.0×106～3×105分子轉動能級微波0.1～100cm3×105～3×102分子轉動能級射頻1～1000m3×102～0.3電子自旋/核自旋當光線通過某種物質的溶液時，透過光的強度會減弱。因為它分成了三部分：在溶液的表面反射或分散；溶液中物質所吸收；透過溶液。入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光“空白”校正：在檢測過程中，若用蒸餾水或待測溶液的溶劑作為“空白”校正反射、分散等因素所造成的入射光的損失，則：入射光(I。)=吸收光+透過光(I)光譜分析技術的分類

分子吸收法:可見與紫外分光光度法、紅外光譜法分子光譜

分子發射法:分子熒光光度法光譜技術原子吸收法：原子吸收法原子光譜原子發射法：發射光譜分析法、原子熒光法等

透過光強度與有色溶液中吸收物質的分子數量c以及透過溶液的厚度L有關。是紫外－可見吸收法定量分析的基礎。

I0：入射光強度C:溶液濃度

b:液層厚度I:透射光強度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系數bI0I2朗伯-比爾定律

1.入射光為單色光。波長范圍越大，單色光純度越低，偏離越大；

2.溶液中鄰近分子的存在并不改變每一給定分子的特性，即分子間互不干擾。

3.適用于分子吸收和原子吸收。朗伯-比爾定律的適用條件9吸光度可加性原理員工隊伍規劃現有員工隊的描述未來的員工隊伍預測差距分析

某一波長的入射光通過幾個相同厚度的不同溶液，其總的吸光度為各溶液吸光度之和。同樣如果溶液中含有不同的吸光物質，只要各組分間沒有相互作用，溶液的總吸光度為各組分吸光度之和。吸光度可加性原理是十分有用的，例如進行光度分析時，試劑或溶劑有吸收，則可從所測總吸光度中直接進行扣除，這就是以試劑或溶劑做空白的依據。10

3顯色反應及其影響因素分光光度法對顯色反應的要求選擇性好、干擾少或干擾容易消除。靈敏度高。一般選擇生成有色化合物的摩爾吸光系數高的顯色反應。有色化合物的組成恒定，符合一定的化學式。有色化合物的化學性質應足夠穩定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度變化很小。有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大。11?

顯色劑的用量?溶液的酸度?

顯色溫度?顯色時間?溶劑?溶液中共存離子的影響影響顯色反應的因素

4顯色劑無機顯色劑因生成的絡合物不夠穩定，靈敏度和選擇性不高，目前應用較少。常用的有硫氰酸鹽、鉬酸銨和過氧化氫等。有機顯色劑該類顯色劑大都屬于含有生色團和助色團的化合物。在有機化合物分子中，一些含有不飽和鍵的基團，它們能吸收大于200nm波長的光，這種基團稱為廣義的生色團。大多數有機顯色劑與金屬離子生成極穩定的鰲合物，且具有特征的顏色，故選擇性和靈敏度都較高。不少鰲合物宜溶于有機溶劑，可以進行萃取比色，這對進一步提高靈敏度和選擇性很有利。

5測量誤差和測量條件的選擇測量誤差

化學誤差（經化學反應將待測組分轉變為包括有色化合物及各種絡合物的過程）、儀器的誤差、人為的誤差。測量條件的選擇

pH、溶劑、溫度、測定時間（時間曲線）、入射光波長（最大吸收峰波長、次吸收峰波長）、參比溶液。14?測量相對誤差與吸光度的關系分光光度計都有一定的測量誤差，實踐證明，吸光度在0.20～0.80內測量的相對誤差較小。相對誤差的最小的部分在透光度為36.8％處(或吸光度為O.4343處)。解決辦法：控制被測溶液的濃度選擇不同的比色皿（比色皿的光程長度為10、30、50、100mm，吸光度小的要用長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。）15

參比溶液的選擇?被測液中僅顯色劑與待測組分生成有色化合物，而顯色劑與其他試劑無色，溶液中亦無其他有色離子時，可用蒸餾水或去離子水作為參比溶液。?除顯色劑與待測組分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色離子，而且顯色劑無色，此時可用不加顯色劑的被測液作為參比溶液。?當顯色劑本身具有顏色時，則用顯色劑溶液作為參比溶液。如果顯色劑和被測溶液都有色時，可將一份試液加入適當掩蔽劑，把被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑反應，再加入與被測溶液相等的顯色劑和其他試劑，這樣的參比溶液能消除共存組分的干擾。6紫外-可見分光光度計分光光度計:能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強度的儀器。分析精密度高測量范圍廣分析速度快樣品用量少射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光根據使用的波長范圍不同分為紫外光區、可見光區、紅外光區以及萬用（全波段）分光光度計等。紫外-可見分光光度計：工作波段在200nm～800nm的分光光度計。200nm～400nm為紫外光區。400nm～800nm為可見光區。721可見分光光度計

722系列可見分光光度計

SP-756P紫外可見分光光度計TENSOR系列紅外光譜儀

0.208光源單色器吸收池檢測器顯示系統紫外-可見分光光度計的基本結構和工作原理紫外-可見分光光度計的基本結構示意圖

光源（lightsource）：提供入射光的裝置。要求:1.能在所需波長范圍的光譜區域內發射連續光譜；

2.有足夠的輻射強度并能長時間穩定。常用的光源有熱輻射燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等。幾種常見光源比較光源波長范圍(nm)

特點鎢燈320~2500鎢絲易蒸發，壽命短。用于可見光區鹵鎢燈320~2500加入鹵素使用壽命延長，穩定性好氫燈185~375用于紫外區氘燈185~375發光強度比氫燈高3～5倍汞燈254~734用于紫外或熒光分析儀單色器（Monochromator）：是將來自光源的復合光分解為單色光并分離出所需波段光束的裝置。入射狹縫：限制雜散光進入；色散元件：將復合光分解為單色光，有棱鏡和光柵兩種；準直鏡：將來自色散元件的平行光束聚集在出射狹縫上；出射狹縫：將固定波長范圍的光射出單色器，可以限制通帶寬度。吸收池（absorptioncell）：是用來盛放被測溶液的器件。在可見光區常用無色光學玻璃或塑料制作；在低于350nm的紫外區需用能透紫外線的石英或熔凝石英制作。同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射應嚴格保持一致。指紋、油污及池壁上的沉淀物都會影響吸收池的透光性能。微型吸收池（Microdrillabsorptioncell）：“光程/體積比”提高了近10倍。多光路吸收池（Multipie-pathabsorptioncell）：在吸收池壁上裝有反射鏡，使光線在溶液中經多次反射后才離開吸收池，大大增加了有效光程，提高了測定的靈敏度。通過改進吸收池的幾何形狀，可提高“光程/體積比”，即盡可能延長單位體積的光程。常用的有：檢測器：把光信號轉換為電信號的裝置。對檢測器的要求：產生的電信號與照射到它上面的光強有恒定的函數關系；波長響應范圍大；靈敏度高；響應速度快，一般要求小于10-8s；產生的電信號易于檢測、放大，噪聲低。幾種常用檢測器比較檢測器

工作原理

特點光電管外光電效應簡單,靈敏度低光電倍增管外光電效應與多級二次發射體相結合靈敏度比光電管高200多倍光電二極管陣列外光電效應，由一行光敏區和二行讀出寄存器構成可同時檢測多個波長的光強度。壽命長、光譜響應范圍寬、可靠性高、讀出速度快光電池內光電效應結實、便宜、使用方便。但產生的電流大小不穩定電荷耦合器件模擬集成電路芯片能同時多譜線檢測，極大地提高分析速度7分光光度技術的應用

A測定溶液中物質的含量比色法：測定標準溶液(濃度已知的溶液)和未知液(濃度待測定的溶液)的吸光度，將兩者進行比較。

Ax/As=KCxL/KCsL，即：Cx=Ax×Cs/As式中Cx代表未知液的濃度，Cs代表標準液的濃度，Ax和As分別代表未知液和標準液所測得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式計算得之。分光度法：先測出不同濃度的標準液的吸光度，繪制標準曲線，在選定的濃度范圍內標準曲線應該是一條直線。測定出未知液的吸光度，即可從標準曲線上查到其相對應的濃度。含量測定時所用波長通常要選擇被測物質的最大吸收波長，原因：①靈敏度大，物質在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；②可以避免其他物質的干擾。

B用紫外光譜鑒定化合物使用分光光度計可以繪制吸收光譜曲線。方法：用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度。以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制吸光度—波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質有其特定的吸收光譜曲線通過比較未知物質與已知物質的吸收光譜曲線形狀（吸收高峰和低谷的波長）來確定紫外光吸收是由不飽和的結構造成的，含有雙鍵的化合物能表現出吸收峰。紫外光吸收光譜比較簡單，同一種物質的紫外光吸收光譜應完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結構不一定相同。除了特殊情況外，單獨依靠紫外光吸收光譜不能決定一個未知物的結構，必須與其他方法配合。紫外光吸收光譜分析主要用于已知物質的定量分析和純度分析。使用分光光度計注意事項儀器須安放在穩固的工作臺上，不能隨意搬動。嚴防震動，潮濕和強光直射。盛裝比色液時，約達比色皿2/3體積，不宜過多或過少