為了棉花姓“中國”1992年，一場史無前例的棉鈴蟲災害以迅雷不及掩耳之勢吞噬著中國的棉田，我國棉花產業遭遇滅頂之災；國外公司拒絕出售抗蟲棉核心技術，到1999年外國抗蟲棉已占領我國95%的棉花市場份額，國內棉花品種市場迅速流失。棉花棉鈴蟲幼蟲2002年成功培育出我國第一個雙價轉基因抗蟲棉新品種——中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲抗藥性。我國成為世界第二個擁有抗蟲基因自主知識產權的國家！第3章基因工程重組DNA技術的基本工具01基因工程的基本操作程序02基因工程的應用03蛋白質工程的原理和應用041944年艾弗里等人證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。1950年埃特曼發明了一種測定氨基酸序列的方法。1958年梅塞爾森和斯塔爾用實驗證明了DNA的半保留復制。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。1967年，科學家發現，在細菌擬核DNA之外的質粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉移。1970年科學家在細菌中發現了第一個限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）。20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發現。1972年，伯格成功構建了第一個體外重組DNA分子。1973年，證明質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA，導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，基因工程正式問世。1977年，桑格等科學家發明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準上市。1983年，科學家采用農桿菌轉化法培育出世界上第一例轉基因煙草。1984年，我國科學家朱作言領導的團隊培育出世界上第一條轉基因魚。1985年，穆里斯等人發明了PCR。1990年，人類基因組計劃啟動。2003年完成21世紀以來，科學家發明了多種高通量測序技術，加速了人們對基因組序列的了解。2013年，華人科學家張鋒及其團隊首次報道利用最新的基因組編輯技術編輯了哺乳動物基因組。該技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。基因工程發展歷程

2020年9月10日，專利審判和上訴委員會（PTAB）裁定，Broad研究所張鋒團隊在其已獲準的專利中擁有將CRISPR系統用于真核細胞的“優先權”，該專利涵蓋了在實驗室培養的人類或直接在人體內的應用。華人科學家張鋒諾獎獲得者杜德娜

2020年諾貝爾化學獎頒給了埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（EmmanuelleCharpentier）和詹妮弗·杜德納(JenniferAnneDoudna），獲獎原因是她們開發了一種新的基因編輯方法——CRISPR/Cas9基因編輯技術。一、基因工程的概念是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫重組DNA技術。原理操作環境操作對象操作水平基本過程目的生物體外基因DNA分子水平定向改造生物的遺傳性狀剪切→拼接→導入→表達優點：定向改造生物體的性狀，目的性強（與誘變育種相比）育種周期短，克服遠緣雜交不親和障礙（與雜交育種相比）基因重組

番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。

到社會中去那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？培育轉基因番木瓜的簡要過程：環斑花葉病毒提取外殼蛋白基因普通番木瓜(無抗病特性)番木瓜細胞(含抗病基因)與運載體DNA拼接，導入番木瓜植株(有抗病特性)表達抗病基因(CP基因）1、不同生物的基因為什么能拼接？2、外源基因為什么能在受體細胞中表達？(1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。(2)DNA分子都遵循堿基互補配對原則(3)雙鏈DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構。(1)基因是控制生物性狀的遺傳物質的結構和功能單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。(3)生物界共用一套遺傳密碼。基因工程誕生的理論基礎“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”思考：解決培育番木瓜的關鍵步驟需要哪些分子工具呢？關鍵步驟一：抗病基因的提取出來關鍵步驟二：抗病基因與運載體DNA“縫合”關鍵步驟三：抗病基因進入

番木瓜限制性內切核酸酶：DNA連接酶：工具分子手術刀分子縫合針分子運輸車載體：準確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞01重組DNA技術的基本工具1、來源：主要從原核生物中分離純化出來

2、種類：

數千種3、作用特點：4、作用部位:特定切點上的磷酸二酯鍵能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。專一性一、限制酶——“分子手術刀”ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵回憶：

磷酸二酯鍵T1234512345A一個核苷酸脫氧核糖上第3位C的羥基，與下一個核苷酸脫氧核糖上第5位C的磷酸羥基，脫水縮合成酯鍵，該酯鍵稱又3,5磷酸二酯鍵。3’5’3’3’5’AGTCTA復習：DNA的空間結構特點：①兩條脫氧核苷酸長鏈反向平行盤旋而成雙螺旋結構。②脫氧核糖和磷酸交替連接，排列在外側，構成基本骨架；堿基排列在內側。③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連接成堿基對，A與T(兩個氫鍵)，G與C配對(三個氫鍵)。堿基之間這種一一對應的關系，叫做堿基互補配對原則。1．推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？2．為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？尋根問底自身DNA不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾(甲基化)限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，從而達到保護自身的目的。5.限制酶識別的特定序列有何特點:呈現堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，或其他數量都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈從5’往3’讀的順序完全一致。【

檢測】下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCC

CTTAAG

CCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATC

GACGTC

GATTTAGD6.限制酶的命名：

用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進一步表示成EcoRI。EcoRⅠ屬名種名菌株數字代表第幾個SmaⅠ：粘質沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個限制酶。7.作用結果：形成黏性末端和平末端。當限制酶在它識別序列的___________將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是__________；當限制酶在它識別序列的_________切開時，產生的是______；中軸線兩側黏性末端中軸線處平末端

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割只能識別GAATTC序列,并在G和A之間切開。平末端平末端SmaI限制酶的切割只能識別CCCGGG序列,并在C和G之間切開

一個限制酶切割一次斷

個磷酸二酯鍵；形成

個黏性末端；有___個游離的磷酸基團；消耗

分子水？兩2思考ATCGTAGC5’3’5’3’兩2下列粘性末端是由同一種限制酶切割而成的是①③兩個黏性末端否由同一種限制酶切割產生的：一看游離堿基能否相互配對二看兩條鏈的切點是否相同。技巧：將黏性末端之一旋轉180°后，若完全相同且切點相同則是。BamHⅠ____EcoRⅠ___HindⅢ___BglⅡ___GATCAATTAGCTGATC討論：請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產生的黏性末端是否一定不同？同種限制酶產生的黏性末端相同，不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端。識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是原核生物數千種1、來源：2、種類：3、作用特點：4、結果：形成兩種末端小結：“分子手術刀”

——限制酶黏性末端平末端①同種限制酶產生的黏性末端相同②不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端。④兩個黏性末端否由同一種限制酶切割產生的：一看游離堿基能否相互配對；二看兩條鏈的切點是否相同。③黏性末端只要互補，即可重新配對。注意：⑤限制酶切一次可產生2個末端和2個游離的磷酸基團，斷2個磷酸二脂鍵，消耗2分子水。CGGCCGTATAATATGCGCGCTTAATCGTATAATATGCTAAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCGTAATCGTTAAAATTCTATACGGCCGTTAAATATTGCTAA如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性末端

缺口怎么辦？二、DNA連接酶——“分子縫合針”將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。1、作用:兩條鏈的骨架部分，形成磷酸二酯鍵

連接部位：CGGCCGTTAAAATTGCTATA類型來源功能相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)2、分類：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATT連接兩個DNA片段DNA連接酶：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶連接單個脫氧核苷酸形成單鏈DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的區別：與DNA相關的五種酶的比較名稱作用部位作用結果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈1.根據所學知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵練習：2.下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化，圖中依次表示限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是(

)

A．①②③④ B．①②④③

C．①④②③ D．①④③②CC2.以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA連接酶將它們連接起來？…CTGCA

…G

①…AC…TG②

CG…GC…③…G

…CTTAA

④G…

ACGTC…

⑤…GC…CG⑥GT…

CA…

⑦AATTC…G…⑧②和⑦能連接形成④和⑧能連接形成③和⑥能連接形成①和⑤能連接形成反向對稱3.關于下圖所示黏性末端的敘述，正確的是A.①與③是由相同限制酶切割產生的B.DNA連接酶可催化①與③的連接C.經酶切形成④需要脫去2分子水D.DNA連接酶與DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端。B重組DNA分子的模擬制作目的要求：模擬重組DNA分子的操作過程，說出其基本原理

剪刀透明膠條ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATACTATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATGTCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATACAGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG（DNA連接酶）（限制酶EcoRⅠ：GAATTC）材料用具：AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？共產生幾個游離的磷酸基團？要切2個切口，產生4個黏性(平)末端，產生4個游離的磷酸基團。重組DNA分子的模擬制作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…重組DNA分子的模擬制作1、

用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要形成幾個磷酸二酯鍵？2個3、外源基因（如抗蟲基因）怎樣才能運送到受體細胞（如棉花細胞）？需要“分子運輸車”——基因進入受體細胞的載體2、不同限制酶切割的末端，是否可以用DNA連接酶進行連接？不一定1.作用:①將目的基因轉移到受體細胞中去②利用運載體在受體細胞內對目的基因進行大量復制1234能夠在宿主細胞中穩定保存和自我復制；具有一個或多個限制酶切位點，便于外源基因插入；具有標記基因，便于重組DNA的鑒定和篩選；對受體細胞無害；2.載體需具備的條件三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”載體上標記基因的標記原理普通培養基不含抗生素選擇培養基50μg/ml四環素四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、熒光蛋白基因有標記基因的存在，可用含青霉素的培養基鑒別。有多個切割位點能復制并帶著插入的目的基因一起復制3.常用運載體：①質粒：一種裸露的、結構簡單、獨立于細胞核或擬核外的并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。②噬菌體、動植物病毒等思考：若用家蠶作為某基因表達載體的受體細胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細胞是細菌，而不是家蠶利用病毒對宿主細胞的侵染性（具物種或組織特異性）☆真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。（1）質粒與擬核中的DNA有哪些相同點：（至少寫出兩點）

①______

。

②______

。

③___________________

。（2）質粒

（是/不是）一種細胞器。（3）細胞膜上的載體蛋白與基因工程中的載體的區別

①化學本質不同：細胞膜上的載體：

。基因工程中的載體可能是物質,如_

;也可是生物,如___

；也可是λ噬菌體的衍生物。

②功能不同：細胞膜上的載體功能是

。基因工程中的載體是一種“分子運輸車”,把

____________

.化學本質和結構相同能夠自我復制具有遺傳效應或都能夠指導蛋白質的合成等不是蛋白質質粒動植物病毒協助細胞膜控制物質進出細胞目的基因導入受體細胞【檢測】辨析填空限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標記基因；④能自我復制或能整合到宿主DNA上。質粒、噬菌體、動植物病毒小結基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

探究·實踐DNA的粗提取與鑒定①DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。③在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。0DNA溶解度NaCl濃度0.14mol/L2mol/L利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1.實驗原理1、了解DNA的物理化學性質；理解DNA粗提取和鑒定的原理。2、學會DNA粗提取的方法以及利用二苯胺試劑對DNA進行鑒定2.目的要求DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。①選材：②試劑：①研磨液②體積分數為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現配現用3.實驗材料不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中無細胞核（無DNA）。——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris-HCl緩沖液（P117）4.實驗步驟(1)稱取約30g洋蔥,切碎,然后放入研缽中,倒入10mL研磨液,充分研磨。(2)在漏斗中墊上紗布,將洋蔥研磨液過濾到燒杯中,在4℃冰箱中放置幾分鐘后,再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心中,1500r/min的轉速下離心5min,再取上清液放入燒杯中。否則細胞核不會充分破碎，釋放出的DNA量就會減少。過濾能用濾紙代替嗎？不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。可能含有DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等。（1）取材研磨（2）去除濾液中的雜質低溫放置幾分鐘的作用

抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；(3)在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%),靜置2~3min,溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向緩慢攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分;或者將溶液倒入塑料離心管中,在10000r/min的轉速下離心5min,棄上清液,將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（1）冷卻的酒精溶液(體積分數95％)作用：①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；②是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。③抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出避免破壞DNA不能形成絮狀沉淀。蛋白質溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。（3）DNA的析出(4)取兩支20mL的試管,各加入2mol/L的NaC1溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaC1溶液中。然后,向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后,將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后,比較兩支試管中溶液顏色的變化。（4）DNA的鑒定【請同學們補充完整以下實驗步驟】試管編號A（對照組）B（實驗組）步驟12mol/L的NaC1溶液5mL步驟2不進行任何處理步驟3步驟4沸水浴加熱5min實驗現象溶液不變藍色實驗結論加絲狀物或沉淀物加4mL的二苯胺試劑溶液逐漸變藍DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺試劑會被染成藍色注意事項1．以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。2.利用動物細胞提取DNA破碎細胞的方法：動物細胞無細胞壁，可直接吸水漲破。3．加入研磨液后，必須充分研磨，否則細胞核不會充分破碎，釋放出的DNA量就會減少。4．加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5．預冷的酒精具有以下優點：①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。刑偵破案拓展：DNA提取的應用基因組測序插入人胰島素基因的大腸桿菌基因工程親子鑒定1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？3.與其他同學提取的