...wd......wd......wd...一種新的細胞擴大方法使用高密度細胞庫，一次性生物反響器和灌注技術byBenjaminWright,MikeBruninghaus,MikeVrabel,JasonWalther,NehaShah,Seul-ABae,TimothyJohnson,JinYin,WeichangZhou,andKonstantinKonstantinov一個典型的細胞培養過程從細胞解凍復蘇開場，隨后通過連續傳代培養對細胞進展擴增，可選用的培養設備包括搖瓶、細胞培養轉瓶、WAVE波浪袋生物反響器和機械攪拌生物反響器等〔1〕。當細胞培養體積和細胞密度到達預定標準時，細胞將轉入到生物反響器中繼續生長并表達產物。這種方法目前還面臨著一些挑戰。搖瓶和轉瓶是細胞放大培養初期使用的主要設備，這兩種設備都需要在超凈工作臺中手動操作，這種情況下容易出現污染，而且易受操作者失誤影響。此外，傳統的細胞庫保存細胞時，凍存管內細胞數量較少，細胞在放大過程中耗時較長。生產用生物反響器體積非常大，需要許多中間型號的培養設備來將種子細胞按比例放大，這將導致需要更長的放大培養時間，并使情況變得更加復雜。生物反響器接種活細胞密度通常低于0.5×106cell/mL,接種細胞后需要培養生長5-10天。在細胞生長期內，由于細胞密度達不到標準不能表達產物或產物含量低，這段時間不能產生實用價值。有研究說明，建設高密度細胞庫可以減少細胞放大的步驟并提高細胞放大成功率。Taoetal.等人建設了高密度細胞庫，每凍存管中活細胞量到達4.5×108個，細胞復蘇后直接接種到20L的WAVE波浪袋生物反響器中〔2〕。這項研究說明，使用高密度細胞庫可以減少中間搖瓶放大步驟并且節約9天的細胞擴大培養時間。Heidemannetal.等人使用高密度細胞庫配合幾種不同大小的一次性生物反響器對細胞進展放大培養，減少了60–70%的培養時間〔3〕。一次性生物反響器相比不銹鋼生物反響器具有許多優點，例如靈活性大大增強，節省安裝、清洗和滅菌時間，減少資本投資等〔4-6〕.GE公司的一次性WAVE波浪生物反響器常常用于種子細胞的擴大培養，該種反響器可以大大減少污染風險〔通常不需要在層流罩下工作〕，而且不需要安裝、清洗和滅菌等操作〔7〕。目前工業化生產中，細胞灌注培養越來越受到人們關注。一些公司已經成功的將細胞灌注培養用于商業化生產中〔9〕。使用灌注培養可以在較小體積的生物反響器中獲得高的細胞密度〔10〕，相比批次培養和流加培養能更快的收獲培養中的不穩定產物〔11〕。由于這些和其他特點，灌注培養常常在最終生產產品的生物反響器上使用，而不在細胞擴大過程中使用。Whitaker(12)andHeidemann(3)簡單提及過灌注培養在細胞擴大過程中的應用，但他們沒有討論灌注培養在改進終端細胞種擴大、減小生物反響器大小、減少生物反響器培養步驟和減少細胞在生產用生物反響器中細胞生長階段時間等方面的潛力。Pohlscheidt(13)使用了一臺帶有傾斜細胞沉降裝置的3000L生物反響器進展細胞灌注培養，細胞密度到達15.8×106個/mL,相比流加培養減少了20%的培養時間。然而，由于細胞別離器對流加速率的限制，細胞長期在次優的條件下生長，想要進一步提高細胞密度變得相當困難〔10〕。在這里，我們描述了一種新的細胞擴大方法，該方法需要使用到高密度細胞庫、一次性波浪生物反響器和交替切向流〔ATF〕灌注培養技術。圖1中比較了一個用常規方法將細胞擴大到500L生產用生物反響器〔n〕中的例子。使用高密度細胞庫方法減少了中間兩個轉瓶培養的步驟，可以直接接種到2L的波浪生物反響器中。使用波浪生物反響器〔2L和20L〕代替轉瓶〔125ml到10L〕大大減少了需要在超凈臺中操作的次數。這種替換使整個過程在一個封閉系統中進展，提高了操作成功率。ATF灌注培養技術在n-1級生物反響器〔圖中為帶有ATF灌注裝置的50L生物反響器〕的應用能使細胞密度大于50×106個/ml。這種細胞擴大方式將使得500L生物反響器接種細胞密度到達5×106個/ml，遠遠超過常規培養時的接種密度0.5×106個/ml。更高的接種細胞密度可以為500L生物反響器減少5天細胞生長時間，可以為500L生物反響器生產線節省50天操作時間。材料和方法細胞系和培養基：市場可買到確實定組分培養基(LifeTechnologies)，添加4毫摩爾谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)。中國倉鼠卵巢細胞系(Genzyme公司專利，能生產一種人類重組蛋白酶)在2L和20L波浪袋生物反響器中擴大細胞:我們解凍一支高密度細胞凍存管(10×107個活細胞/ml,4.5mL/支)直接接種2L波浪袋生物反響器(GEHealthcareLifeSciences)，工作體積為1L。當細胞密度到達3.0×106個/mL時，我們將細胞擴大到20L波浪袋生物反響器中培養，工作體積為7.5L。一個20/50EHTDWave生物反響器系統(GEHealthcareLifeSciences)作為2L和20L生物反響器搖擺平臺，控制培養溫度37°C,搖晃速度16rpm，搖晃角度7°，20%的O2和5%的CO2混合氣體以0.25slpm的速度進入頂部空間。種細胞n-1反響器灌注培養:我們使用了一臺15L玻璃生物反響器(Broadley-JamesCorporation)，配備了ATF4灌流裝置來模仿n-1細胞種擴大階段(圖1中的50L生物反響器)。一個20um的微孔進氣管加氧氣，控制溶解氧(DO)在40%；一個1mm孔徑的進氣管加氮氣，控制溶解的co2水平<120mmHg壓力。根據需要，我們添加了0.5M碳酸鈉以保持Ph>6.85,添加10%消泡劑(LifeTechnologies)控制泡沫水平。我們使用一臺15L的生物反響器進展細胞培養，工作體積為10L，接種細胞密度0.5×106個/ml，批次培養兩天后開場灌注培養。在開場，使用一個活細胞濃度在線分析電極(AberInstruments)和可編程邏輯控制程序(EmersonProcessManagement)控制灌注速率為0.2nL/cell/day。當活細胞濃度到達20×106個/ml時，限制灌注速率為每天4個工作體積。50ml轉管批次換液培養模型評價接種不同細胞密度：當n-1級種子反響器中細胞密度到達25×106、50×106、100×106個/ml時分別取樣，接種到50ml轉管〔TPPTechnoPlasticProducts〕中，接種密度為0.5×106、2.5×106、5.0×106個/ml三種不同密度類型，工作體積為10ml，每個培養管做3份平行樣。由于轉管不能做灌注，采取每天換液的方式培養。從第一天開場給轉管更換培養基，更換方法是將轉管從培養箱拿出后用1100rpm離心5min，棄上清，參加新鮮培養基重懸細胞。這種換液策略能夠保證接種不同濃度細胞的轉管具有一樣的換液速率。轉管在高頻脈沖恒溫搖床〔HTInfors〕中培養，培養條件為37°C，搖晃頻率160rpm，角度45°，相對濕度80%，CO2濃度5%。生產用生物反響器：我們采用一臺15L的生物反響器〔Broadley-JamesCorporation〕來模擬圖1中的500L生物反響器，工作體積為10L，配備了ATF4灌流裝置(RefineTechnology)和0.2um孔徑的PES材質過濾器。一個20um的微孔進氣管加氧氣，控制DO為40%，一個1mm孔徑的管加氮氣，，控制溶解的co2水平<120mmHg壓力，添加了0.5M碳酸鈉以保持Ph>6.85,使用蠕動泵添加10%消泡劑(LifeTechnologies)控制泡沫水平。一套生產用生物反響器接種批次培養獲得的種子細胞，細胞接種密度較低(5.0×106個/ml)。培養一天后開場灌注培養，灌注速率為0.5個培養體積/天，然后每天增加0.5個培養體積，直到灌注速率到達2個培養體積/天。另一套生產用生物反響器接種n-1灌注種子罐培養獲得的細胞，細胞接種密度較高〔5.0×106個/ml〕。由于接種密度較高，接種細胞的同時開場進展灌注培養，灌注速率為2個培養體積/天。兩套生物反響器安裝活細胞濃度在線分析電極，使用該電極和蠕動泵控制活細胞濃度在40×106個/ml，培養運行50天。分析方法：我們使用ViCellXR細胞存活率分析儀(BeckmanCoulter)檢測活細胞濃度，使用RAPIDLab血氣分析儀(Siemens)離線檢測pHandpCO2，使用特異光度酶活性分析法定量蛋白質含量。結果和討論在n-1細胞種生物反響器中使用ATF灌注方法進展高密度細胞培養：圖2展示了包括波浪袋生物反響器和n-1生物反響器在內的細胞種活細胞密度曲線。2L的波浪袋生物反響器培養8天，20L的波浪袋生物反響器培養5天，n-1生物反響器培養12天，最終細胞密度到達110×106個/ml，細胞存活率大于98%。在培養9天后，細胞密度到達50×106個/ml，可以滿足接種500L反響器時接種密度到達5×106個/ml〔假設n-1反響器體積為50L〕。從培養2天后開場，n-1生物反響器維持灌注速率為0.2nL/cell/day，補料速度隨著細胞密度升高而自動加快。成功使用這種補料策略需要活細胞濃度在線分析電極能準確的測定出活細胞的濃度。在這里，我們僅僅使用這種策略持續到第7天，然后將灌注速率改為4個培養體積/天。在細胞生長期使用這種控制策略可以準確的控制灌注速率，有利于細胞生長。之前有報道說明，0.05–0.10nL/cell/day的灌注速率差異會對細胞生長和產品表達產生影響〔14〕。我們的策略中，灌注速率隨細胞生長自動調整，可以防止這種差異造成的影響，相比之下，在批次逐步放大過程中，操作人員需要手動調節速率〔15〕。評估n-1細胞種生物反響器細胞傳代密度和終端生產生物反響器細胞接種密度對細胞生長的影響：我們使用一個小型的轉管模型來推斷n-1種子反響器中細胞密度是如何影響終端生產用生物反響器內細胞生長的。當n-1反響器中細胞密度到達25×106、50×106、100×106個/ml時分別取樣，每種樣品接種到三個轉管中，接種密度為0.5×106、2.5×106、5.0×106個/ml三種不同密度類型，每個培養管做3份平行樣。每天更換培養基，更換培養基頻率根據接種細胞密度進展調整，保證每個培養轉管在一樣細胞密度下有同樣的灌注速率。圖4比較了不同接種密度條件下細胞的數量和活力。由于轉管最大灌注速率為1個培養體積/天，為了和生物反響器相匹配，我們僅僅將細胞密度培養到20×106個/ml。我們觀察到不同細胞密度取樣和三種不同接種密度對細胞生長沒有明顯影響，但是在n-1種子反響器中細胞密度為100×106個/ml時取的樣品在接種初期細胞活力相對較低。為了研究n-1反響器的細胞傳代密度和生產反響器的接種密度對細胞生長和生產率的影響，我們做了相應的比照實驗。一組采用n-1反響器細胞密度50×106個/ml時傳代，接種密度為5×106個/ml。另一組采用n-1反響器細胞密度2.5×106個/ml時傳代，接種密度為0.5×106個/ml。圖5對這兩種情況進展了比較。在整個50天培養過程中，兩種接種條件的細胞都保持了90%以上的細胞活力。圖6說明的是在不同接種條件下特定產物和細胞總量之間的對應關系。很明顯，在接種密度高的情況下，細胞密度穩定在40×106個/ml〔圖5〕并高濃度表達產物的時間提前了4到5天。經濟優勢和操作優勢：我們的細胞擴大方法在經濟和操作兩方面都具有優勢。例如以5×106個/ml細胞密度接種500L生物反響器可以減少4-5天細胞培養時間，相比50天的培養周期提升了10%的生產力。我們已經實現在n-1階段反響器上將細胞密度培養到100×106個/ml，如果使用10×106個/ml細胞密度接種500L生物反響器，可以再減少5-6天細胞生長時間。如果終端生產生物反響器使用的時批次或者流加工藝，這種細胞擴大方法同樣可以用來提供種子細胞。如果一個流加培養的500L生物反響器培養周期為21天，使用5×106個/ml細胞接種密度可以縮短25%的培養時間，這樣每年可以多生產5-6批產品，提升25%-30%的生產效率。通常情況下，批次培養和流加培養比灌注培養需要更大體積的生物反響器，細胞放大過程需要多級不同型號生物反響器。圖7對常規放大過程和流加反響器放大過程接種10000L生產反響器進展了比較。在n-1階段使用50L生物反響器灌注培養，細胞密度到達50-100×106個/ml時接種10000L生物反響器，接種密度為0.25-0.5×106個/ml，這樣可以減少兩個中間放大步驟。這種方法的好處是可以減少250L的反響器和500L的反響器，節省使用空間，同時大量減少前期資本投入。一種簡化的細胞擴大方法：我們的研究結果說明這種新的細胞擴大方式是完全可行的，這種方法需要使用高密度細胞庫、一次性反響器和n-1階段生物反響器灌注技術。這種新的細胞放大程序減少了一些細胞放大步驟，省略了許多清洗、安裝和滅菌過程，大大簡化了細胞擴大程序。工業化生產可以使用同樣的操作策略，用50L的生物反響器替代n-1階段設備，用500L的生物反響器替代終端生產生物反響器。在n-1階段生物反響器上使用ATF灌注技術，培養12天后細胞密度不超過100×106個/ml，此時進一步放大培養不會改變細胞生長特性。我們的研究說明，使用5×106個/ml細胞密度接種500L生物反響器可以使細胞培養擴增時間減少4-5天，從而使50天的培養周期中生產生物產品時間提高10%。在n-1階段使用灌注技術的方法可以可以有多個變種，例如可以使用500L生物反響器作為n-1階段細胞種子反響器，接種細胞密度提高到10×106個/ml。相比批次培養和流加培養，當使用更大的生物反響器生產時〔比方10000L〕,我們可以在n-1階段使用50L灌注生物反響器作為種子反響器，通過提高細胞密度減少傳代擴大步驟。References1 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