第三章血細胞分析儀檢驗

簡介手工計數法的局限性儀器優勢：精度高、速度快、易操作、功能強血液分析儀發展血液分析儀功能：細胞計數、白細胞分類、擴展功能★20世紀50年代，美國庫爾特（W.H.Coulter）發明電子血細胞計數儀并申請專利。血液分析儀優勢檢測項目多速度快精度高易操作第一節檢測原理1.電學2.光學電阻法射頻電導法激光散射法：染色和非染色分光光度法---檢測血紅蛋白

一.血細胞計數原理電阻抗法經典的庫爾特原理測量細胞數量和體積三分群血液分析儀主要原理電阻抗法血小板與紅細胞同一檢測通道特殊裝置輔助:掃流技術、鞘流技術、浮動界標。射頻電導法電磁波通過細胞發生衰減，與細胞內部化學成分、核質比、顆粒等有關。特別有助于鑒別體積相同，內部結構不同的細胞。激光散射法在不同角度測定散射光強度，與細胞表面結構和內部顆粒、細胞核有關。比電阻抗法分群準確，是五分類儀器主要檢測原理。光源：氣體激光、固體激光、鎢光源鞘流：流體動力聚焦細胞懸液光檢測器143激光散射法示意圖1樣本流2鞘流液3激光源4透鏡5低角度散射光6高角度散射光652激光散射法低角度散射光（前向散射光），反映細胞大小和數量。高角度散射光（側向散射光），反映細胞內部顆粒、細胞核等。流式細胞術光散射：熒光染色，得到熒光強度信號，與細胞所含核酸有關。優于阻抗法，是五分類儀器的主要原理之一。12633nm650nm以上

核酸量（DNA和RNA)側向熒光半導體激光染色后的白細胞FCM原理核和顆粒側向散射光細胞體積

前向散射光激光散射法運用白細胞計數紅細胞計數：低角度(2°～3°)：測量紅細胞體積。高角度(5°～15°)：測定血紅蛋白濃度。血小板計數：低角度(2°～3°)：測量細胞大小。高角度(5°～15°)：測量細胞密度?？膳c小RBC、RBC碎片區分。

加入熒光染色，成熟RBC無DNA/RNA，不被染色。未成熟血小板染色較成熟血小板強。網織紅細胞檢測原理對網織紅細胞內RNA成分染色。染色劑有：非熒光染料（新亞甲藍）和熒光染料(噁嗪、聚次甲基）非熒光染料染色法：VCS技術

RNA越多光散射越強，可檢測網織紅細胞成熟度得到參數：Ret%、Ret#、IRF\HLR\MCVr\RDWr網織紅細胞參數檢測原理熒光染料染色法

聚次甲基染RNA、噁嗪染DNARBCLFRPLTMFRHFR得到參數：Ret%、Ret#HFR\MFR\LFRIRF\Ret-He熒光強度前向散射光有核紅細胞參數檢測原理VCS法

非白細胞區域：有核紅、血小板聚集、大血小板、瘧原蟲等。流式細胞激光散射法

聚次甲基熒光染色：NRBC裸核化，熒光強度比白細胞低。NRBCWBC前向散射光側向熒光

二.白細胞分類原理白細胞三分群原理★白細胞直方圖儀器將體積為35～450fL的血細胞，分為256個通道（channel）。每個通道：1.64fl。根據細胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細胞體積分布直方圖(Histogram)。

★白細胞直方圖1.35-90fl小細胞群：淋巴2.90-160fl中間細胞群：單核、嗜酸、嗜堿、幼稚3.160-450fl大細胞群：中性粒細胞直方圖出現異常，不同部位有不同含義

體積電導光散射白細胞五分類檢測原理VCS原理VCS旋轉光散射體積激光散射法（鎢光源）、過氧化物酶染色過氧化物酶活性強度：嗜酸>中性粒細胞>單核。淋巴和嗜堿細胞無過氧化酶活性★流式細胞光散射、電阻抗、射頻、特殊細胞染色1.4DIFF通道

阻抗+射頻：分粒細胞、淋巴、單核三群

流式光散射：溶解紅細胞、血小板，白細胞熒光染色，熒光強度與細胞所含核酸有關。先分四群：中性粒細胞和嗜堿細胞，淋巴，單核，嗜酸和未成熟粒細胞。2.嗜酸細胞通道3.WBC/BASO通道

堿性溶血劑破壞其他白細胞。4.IMI通道

加入硫化氨基酸，與幼稚細胞結合，且不被溶血劑溶解。幼稚粒細胞異常淋巴嗜酸中性單核淋巴嗜堿嗜堿其他白細胞WBC/BASO通道完成五分類

多角度偏振光散射法（MAPSS)

紅細胞內血紅蛋白逸出，鞘液進入，折光系數與鞘流相當，不干擾白細胞檢測。4個角度：0°前向散射光：細胞大小、數量10°側向散射光：細胞內部結構和核染色質的復雜性。90°偏振光：細胞內顆粒及核分葉情況90°D垂直角度去偏振散射光：鑒別嗜酸細胞MAPSS雙流體（雙鞘流）動力連續系統雙鞘流：有2個鞘流裝置，經第一束鞘流后用阻抗法測細胞體積，經第二束鞘流后測定光吸收測細胞內部結構。1.白細胞計數通道：電阻抗2.白細胞分類通道：雙鞘流+細胞化學染色

染液中含溶血素及氯唑黑E，對單核細胞初級顆粒、嗜酸顆粒、中性顆粒及細胞膜（細胞膜、核膜、顆粒膜）染色。3.嗜堿性粒細胞通道分光光度法測定血紅蛋白:溶血劑使紅細胞溶血，釋放出血紅蛋白，血紅蛋白與溶血劑中某些成分結合，形成穩定化合物，在特定的光波（530-550nm）下比色，吸光度變化與血紅蛋白濃度成正比(Lambert-Beer比色定律)。溶血劑

1.含氰化物：形成氰化血紅蛋白，540nm(改良HiCN法）。氰化物有毒。

2.不含氰化物:如SLS（月桂酰硫酸鈉）法，需用HiCN校準。方法學評價三分類已較少用五分類，準確度及精密度更高。仍無法取代人工鏡檢。

第二節臨床應用紅細胞參數紅細胞體積分布寬度（RDW）反映紅細胞大小不一致的程度，與MCV結合，用于貧血的分類。RDW-SD和RDW-CV。1.鑒別均為小細胞低色素的貧血2.早期診斷缺鐵性貧血2.MCV和RDW均增高：巨幼細胞性貧血3.MCV和RDW均正常：再障、慢性失血性貧血紅細胞參數血紅蛋白分布寬度（HDW）反映紅細胞內HB含量異質性。HDW和RDW明顯增高，見于遺傳性球形紅細胞增多癥（小細胞不均一性高色素）。HDW增高，RDW正常見于輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血。球形細胞平均體積（MSCV)遺傳性球形紅細胞增多癥MSCV<MCV血小板系列參數血小板平均體積（MPV)、未成熟血小板比率（IPF)、血小板分布寬度（PDW)MPV正常人MPV與PLT呈非線性負相關。1.鑒別血小板減低的原因：MPV增高，骨髓增生功能良好，血小板減低是由于血小板破壞過多；MPV減低，再障或急性白血病。2.評估骨髓造血功能恢復情況：造血功能恢復時，MPV增高早于PLT增高。3.原發性血小板減少性紫癜（ITP）PLT、MPV、PDW？★IPF網織血小板是胞質中殘留RNA的血小板。鑒別血小板減低的原因：骨髓造血功能良好時，IPF增高。網織紅細胞參數未成熟網織紅細胞比率（IRF）、網織紅細胞成熟指數（RMI)、Ret-He用于評估骨髓造血功能，貧血的鑒別診斷。1.IRF、RMI：腫瘤化療、干細胞移植骨髓造血功能受抑和恢復最早的指標（早于WBC、PLT、Ret）

IRF=(MFR+HFR）/(LFR+MFR+HFR)*100RMI=(MFR+HFR）/LFR*1002.Ret-He網織紅細胞血紅蛋白含量：反映網織紅細胞質量，對缺鐵貧的治療有意義。白細胞系列參數中間細胞群MID、未成熟粒細胞IG、造血祖細胞HPCMID：單核細胞、嗜酸、嗜堿、幼稚細胞、異淋、漿細胞IG：早幼粒細胞至桿狀核粒細胞各階段，不包括原始粒細胞。HPC：干細胞移植時，檢測供體HPC變化，便于選擇采集時機。

第三節血細胞分析儀檢驗圖形與臨床應用第二節檢測參數和結果顯示儀器應滿足的兩個要求：1.篩檢和直接報告正常結果2.報警提示異常結果：結果超出范圍、細胞異常、標本干擾等結果顯示：數據、圖形（直方圖、散點圖）、報警（圖形、符號、文字）

直方圖：曲線圖形，XY軸？

散點圖：點組成的圖形，XY軸？數據參考值符號直方圖★白細胞直方圖儀器將體積為35～450fL的血細胞，分為256個通道（channel）。每個通道：1.64fl。根據細胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細胞體積分布直方圖(Histogram)。

★白細胞直方圖1.35-95fl小細胞群：淋巴2.95-160fl中間細胞群：單核、嗜酸、嗜堿、幼稚3.160-450fl大細胞群：中性粒細胞直方圖出現異常，不同部位有不同含義正常白細胞直方圖異常白細胞直方圖分析白細胞直方圖應注意：溶血劑處理后白細胞直方圖變化必須使用配套試劑不同儀器的直方圖不同★紅細胞直方圖1.近似正態分布，單峰，36-360fl監測，主要分布于50-200fl2.橫坐標：細胞體積；縱坐標：細胞的出現頻率3.異常圖形：左移右移、峰高低、峰寬窄、雙峰等紅細胞異常直方圖★血小板直方圖1.左偏態分布，單峰，主要在2-15fl，2-30fl檢測2.異常圖形：大血小板、血小板聚集、小RBC、RBC碎片散點圖-白細胞每一條軸分別表示一種檢測原理或檢測角度的細胞信息，任何一個點反映的是綜合信息。散點上下、左右、前后的變化與細胞大小、內部結構、顆粒、胞核胞質等有關。散點圖-紅細胞紅細胞體積/紅細胞血紅蛋白濃度（V/HC）散點圖：分九個區，有助于貧血的分類和診斷。

第四節血細胞分析儀性能評價與全面質量控制性能評價安裝新機或大維修后需進行儀器性能評價，包括：精密度批內精密度：同一批樣本重復測定結果的評價。批間精密度：對兩批或以上樣本重復測定結果的評價。總精密度：同一標本多次測量的結果接近程度，包含隨機誤差和攜帶污染率雙重變異因素。準確性：測定結果與真值一致性的程度（表3-14）準確度和精密度★性能評價線性范圍（稀釋效應）：指測定值與稀釋倍數是否呈比例關系。線性關系范圍越寬越理想。P＜0.01,非線性相關；P＞0.05，未偏離線性。MCHMCHCMCVRBC★性能評價攜帶污染率連續測定1份高值樣本3次（i1、i2、i3）再測定1份低值樣本3次（j1、j2、j3）攜帶污染率（%）＝（j1-j3）/（i3-J3）

可比性（儀器與常規檢測程序）：

指血液分析儀測定結果，與常規方法所測結果相比較。顯微鏡法是血細胞檢驗基礎。對異常標本和干擾物的靈敏度標本老化：觀察標本隨時間變化對結果的影響白細胞分類計數評價（表3-15）全面質量控制質量保證、儀器校準和性能評價均有國際公認的一系列標準文件。質量保證

分析前：環境、儀器、試劑、校準品、質控品、參考區間的設置、合格的檢測人員及標本

分析中：室內質控、操作規范、報警處理、干擾因素分析、復檢規則

分析后：樣本保存、結果分析、征求臨床意見、室間質評室內質量控制質控品要求：穩定血制品或新鮮全血1至少兩個水平，頻率依工作量和儀器性能而定2更換新批號應新舊批號同時檢測3結果解釋：±2S（95%可信限）4報警報警來源：標本異常，超出項目參考范圍，符合復檢標準報警形式：圖形、符號、文字報警信息：（表3-18---3-21)報警處理干擾因素分析RBC:WBC增加、RBC凝集、大PLT、PLT聚集HB：脂血、高膽紅素、WBC高、PLT高WBC：有核紅、未溶解RBC、WBC聚集PLT：小RBC、RBC碎片、PLT聚集、大PLT、WBC碎片復檢規則國際血液分析儀顯微鏡復檢規則41條

鏡檢三方面內容：1.取細胞分布良好的區域，估算WBC、PLT(正?？梢?-15個血小板/油鏡視