CRISPR/Cas9

Whatis

CRISPR？

【CRISPR】clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat。

成簇規律間隔短回文重復。是一種基因組編輯工具，它能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯工具。CRISPR/Cas9系統的發現CRISPR/Cas系統最早是在細菌的天然免疫系統內發現的，其主要功能是對抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大學（OsakaUniversity）的研究人員在E.coliK12的堿性磷酸酶基因附近發現了成簇的規律間隔的短回文重復序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR），目前普遍認為有40%的細菌基因組具有這樣的結構。CRISPR/Cas9系統的組成.CRISPR/Cas9系統由CRISPR序列元件與Cas基因家族組成。其中CRISPR由一系列高度保守的重復序列（repeat）與同樣高度保守的間隔序列（spacer）相間排列組成。而在CRISPR附近區域還存在著一部分高度保守的CRISPR相關基因（CRISPR-associatedgene,Casgene）這些基因編碼的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以對DNA序列進行特異性的切割。CRISPR/Cas9系統元件與特征CRISPR的結構（以嗜熱鏈球菌LMD-9基因組CRISPR1/Cas系統的位點為例）。藍色表示Cas基因，包括廣泛存在的cas1和cas2，II類系統特征基因cas9和csn2。黑色表示重復間隔物序列（CRISPR）。黑色菱形表示CRISPR的重復序列（repeat）灰色長方形表示間隔物序列（spacer）。縮寫：L，前端；T，末端；CRISPR/Cas9系統工作原理CRISPR/Cas作為原核生物中普遍存在的一種系統，最初的功能就是識別外源性入侵的核酸序列，并對其進行特異性降解，以達到抗病毒的作用。這一過程分兩步進行——crRNA的合成及在crRNA引導下的RNA結合與剪切，包含crRNA的生物學合成和RNA的結合與剪切兩大步驟。CRISPR/Cas9系統工作原理step1CRISPR區域第一個重復序列上游有一段CRISPR的前導序列（Leadersequence），該序列作為啟動子來啟動后續CRISPR序列的轉錄，轉錄生成的RNA被命名為CRISPRRNA（簡稱crRNA）。step2CRISPR/Cas系統中crRNA與tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即單向導RNA（SingleguideRNA,sgRNA）。sgRNA可以介導Cas9蛋白在特定序列處進行切割，形成DNA雙鏈斷裂（Double-StrandedBreak,DSB），從而完成基因定向剪切編輯等各類操作。CRISPR/Cas9系統的分類CRISPR/Cas系統可以分為I類系統、II類系統和III類系統。這三類系統又可以根據其編碼Cas蛋白的基因不同而分為更多的亞類。不同類型CRISPR/Cas系統完成干擾的步驟也有所不同。CRISPR/Cas9系統的分類CRISPR/Cas9系統的分類在I類系統中，入侵的DNA有Cascade:crRNA復合體識別，PAM模塊則能促進外源性DNA的識別，隨后核酸酶Cas3被募集并將目標DNA降解。在II類系統中，只需要單獨的Cas9蛋白即可完成干擾，并不依賴一個多蛋白復合體，Cas9和反式激活的crRNA（tracrRNA）、前crRNA（pre-crRNA）形成復合體，該復合體促使RNA酶III將前crRNA加工為成熟的crRNA。在III類系統中，一個多蛋白復合體（Csm或Cmr）或Cas6促進前crRNA轉化為成熟的crRNA，最終導致目標DNA的降解II類CRISPR/Cas9系統它是利用一段小向導RNA（sgRNA）Cas9復合體系統靶向基因組編輯的步驟。將編碼密碼子優化的Cas9（紅色）序列、一段核定位序列（NLS）和一段包括目標靶序列的小向導RNA（sgRNA，黃色）序列同時構建在一個質粒中，再將質粒轉染進目標細胞。一個有功能的sgRNA:Cas9干擾復合體會在細胞內完成組裝，該復合體會在PAM結構的上游目標DNA序列上誘導產生一個雙鏈斷裂（DSB），而DSB則能被宿主細胞的DNA修復系統、同源重組系統（HR）和非同源末端連接途徑（NHEJ）修復。HR系統以宿主的等位基因為模板復原野生型序列，將序列恢復為斷裂前的狀態；而容易出錯的NHEJ系統則會在目標位點（灰色）引入插入和刪失。使用一段合成的供體DNA模板與Cas系統質粒共轉染，可以誘導HR（藍色），提高編輯效率。II類CRISPR/Cas9系統CRISPR技術的應用近年來，由于基因工程技術的突飛猛進，CRISPR/Cas儼然已經成為科學界最炙手可熱的熱點之一被廣泛應用于各類體內和體外體系的遺傳學改造、轉基因模式動物的構建，甚至基因治療領域，在結合誘導多能干細胞（iPS）技術，人們可以將通過基因編輯修復的iPS細胞重新發育為正常組織和器官來供病人使用。CRISPR/Cas9存在的問題CRISPR的基因打靶系統，可讓我們編輯基因組中特定靶位點的遺傳信息。這種新方法揭示的系統，有可能會結合意想不到的位點，導致其中一些位點發生基因突變，這些突變可能對藥物療法的研究與開發，產生嚴重的后果。CRISPR/Cas9存在的問題同其他基因工程的方法手段一樣，CRISPR/Cas9技術手段的產物同樣也會存在并引起一些轉基因方面的爭議。CRISPR技術與其他基因技術對比

THREEONETWOCRISPRZNF

TALENCRISPR技術與其他基因技術對比不論是TALEN技術還是ZFN技術，其定向打靶都依賴于DNA序列特異性結合蛋白模塊的合成，這一步驟非常繁瑣費時。而CRISPR/Cas技術作為一種最新涌現的基因組編輯工具，能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。CRISPR/Cas技術使用一段序列特異性向導RNA分子（sequence-specificguideRNA）引導核酸內切酶到靶點處，從而完成基因組的編輯。CRISPR/Cas系統的開發為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新的平臺。CRISPR技術相關專利科學家雜志4月15日報道，著名的Broad研究院宣布，他們獲得了第一份熱門基因組編輯技術：CRIS