樣品離子化研究主講人：付建武江西中醫(yī)學院研究生部質譜(MS)法常用的離子化方式：基本原理是將供試物分子經一定離子化方式，如電子轟擊或其它離子化方式，一般是把分子中的電子打掉一成為M+，繼之裂解成一系列碎片離子，再通過磁場使不同質荷比(m/z)的正離子分離并記錄其相對強度，繪出MS圖。即可進行元素分析、分子量測定、分子式確定和分子結構的解析和推斷等等。離子源的作用是接受樣品產生離子，常用的離子化方式有：電子轟擊離子化（electronimpactionization，EI）、化學離子化(ChemicalIonization,CI)、場致離子化(FieldIonization,FI)、場解吸離子化(FieldDesorptionIonization,FD)、負離子化學離子化(NegativeIonCI,NICI)、快原子轟擊(FastAtomicBombardment,FAB)、激光解吸(LaserDesorptionInoization,LD)等等。質譜法常用的離子化方式質譜有多種電離方法，每一種電離方法都有一定的分子量檢測范圍，一般認為熱噴霧的分子量檢測最大范圍約8ku，快原子轟擊為25ku。但是隨著分子質量的增加，所有分析方法的靈敏度均有所下降。離子源將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉化成離子。離子源是質譜儀的心臟，可以看作是比較高級的反應器，樣品在其中發(fā)生一系列的特征降解反應，分解作用在很短時間（～1μs）內發(fā)生，所以可以快速獲得質譜。軟電離方法能量的較低電離方法適用于易破裂或易電離樣品

不同分子離子化所需要的能量差異很大，應選擇不同的離解方法。硬電離方法能量較高的電離方法各種離子源的基本特征電子轟擊源(ElectronIonization,EI)++++:R1:R2:R3:R4:e+M+(M-R2)+(M-R3)+MassSpectrum(M-R1)+用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產生正離子（M＋e→M+＋2e）以及碎片離子。M為待測分子，M+為分子離子或母離子。碎片離子指分子中某些化學鍵斷裂而產生的質量較小的帶正電荷的碎片。大多數(shù)質譜法只研究正離子，EI源：可變的離子化能量

(10~240eV)

對于易電離的物質降低電子能量，而對于難電離的物質則加大電子能量（常用70eV）。電子能量電子能量分子離子增加碎片離子增加EI離子源的產生過程：使有機分子被一束電子流（能量一般為70eV）轟擊，失去一個外層電子，形成帶正電荷的分子離子（M+），M+進一步碎裂成各種碎片離子、中性離子或游離基，在電場作用下，正離子被加速、聚焦、進入質量分析器分析。電子轟擊離子化可使分子引起相當大的碎裂，所得分子離子峰往往并不很強甚至不能識別。分子較大碎裂對供試藥物的鑒定和結構解析是十分有利的；但對混合組分的分析和藥物純度檢查是不利的。電子轟擊離子源裝置原理在此裝置中，由陰極發(fā)射出的電子經加速后在飛向陽極過程中，與由進樣器輸入的樣品分子碰撞而引起電離。所產生的離子由靜電透鏡引出電離室，經加速、聚焦成一定能量和強度的離子束，通過出口狹縫進入質量分析器。電離室通常保持一定的真空度和溫度。陰極發(fā)射的電子數(shù)通過調節(jié)陰極燈絲溫度加以控制，而電子的能量則通過控制兩極上的外加電壓來調整。靜電場通常保持在6-100V范圍內。其特點是能得到較強而穩(wěn)定的離子流，但要求樣品只能是氣態(tài)的原子或分子。EI源的特點：

應用最廣，標準質譜圖基本都是采用EI源得到的；電離效率高，能量分散小，結構簡單，操作方便。圖譜具有特征性，化合物分子碎裂大，能提供較多信息，對化合物的鑒別和結構解析十分有利。所得分子離子峰不強，有時不能識別。本法不適合于高分子量和熱不穩(wěn)定的化合物。缺點：質譜圖中分子離子峰很弱或不出現(xiàn)（由于電子的能量高，分子離子進一步離解成碎片離子）電子轟擊電離的靈敏度和分辨率一定能量的電子直接作用于樣品分子，使其電離，且效率高，有助于質譜儀獲得高靈敏度和高分辨率。有機化合物電離能為10eV左右，50-100eV時，大多數(shù)分子電離界面最大。70eV能量時，得到豐富的指紋圖譜，靈敏度接近最大。適當降低電離能，可得到較強的分子離子信號，某些情況有助于定性。質譜中提供的重要信息之一是獲得樣品的相對分子質量?；瘜W電離源是采用較溫和的、通過離子—分子反應進行的化學電離法。化學電離法就是用高能電子（100~240eV）轟擊離子室內的反應氣（甲烷、甲烷、異丁烷、氨氣等；10~100Pa，樣品的103~105倍，避免樣品與電子碰撞），甲烷分子先被電離，形成一次、二次離子，

化學電離源（ChemicalIonization，CI）++氣體分子試樣分子+準分子離子電子(M+1)+;(M+17)+;(M+29)+;這些離子再與樣品分子發(fā)生反應，形成比樣品分子大一個質量數(shù)的（M+1）離子，或稱為準分子離子。準分子離子也可能失去一個H2，形成（M-1）離子。化學電離源的特點準分子離子峰強；不會發(fā)生象EI中那么強的能量交換，較少發(fā)生化學鍵斷裂，譜形簡單。；不適用難揮發(fā)試樣；不會發(fā)生象EI中那么強的能量交換，較少發(fā)生化學鍵斷裂，譜形簡單。分子離子峰弱，但（M+1）峰強，這提供了分子量信息。電子轟擊的缺陷是分子離子信號變得很弱，甚至檢測不到?；瘜W電離引入大量氣體試劑，使樣品分子與電離離子不直接作用，利用活性反應離子實現(xiàn)電離，其反應熱效應可能較低，使分子離子的碎裂少于電子轟擊電離。商用質譜儀一般采用組合EI/CI離子源。試劑氣一般采用甲烷氣，也有N2,CO,Ar或混合氣等。試劑氣的分壓不同會使反應離子的強度發(fā)生變化，所以一般源壓為0.5-1.0Torr。場致電離源（fieldionization,FI）應用強電場誘發(fā)樣品電離（量子隧道效應）電壓：7-10kV；d<1mm；強電場將分子中拉出一個電子，電離后被陽極排斥出離子室并加速經過狹縫進人質量分析器。陽極+++++++++++++陰極d<1mm場離子化是一種溫和的技術，產生的碎片很少。主要為分子離子和（M＋l）離子。碎片通常是由熱分解或電極附近的分子一離子碰撞反應所產生。在結構分析中，往往最好同時獲得場離子化源或化學離解源產生的質譜圖和用電子轟擊源的質譜圖，而獲得相對分子質量及分子結構的信息。

場致離子化的特點非常適用于易變分子的離子化，如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺類藥物均宜采用；此法也能產生較強的分子離子峰和準分子離子峰。分子離子峰強；碎片離子峰少；不適合化合物結構鑒定；當樣品蒸汽鄰近或接觸帶高的正電位的金屬針時，由于高曲率半徑的針端處產生很強的電位梯度，樣品分子可被電離，這稱為場電離。場電離要求樣品分子處于氣態(tài)，靈敏度又低，因而應用逐漸減少。場解吸的原理與場電離相同，但樣品是被沉積在電極上。為增加離子的產率，電極上有很多微針（microneedles）。在電場的作用下（或再輔以溫和地加熱），樣品分子不經汽化而直接得到準分子離子，因而場解吸適合于難汽化的、熱不穩(wěn)定的樣品，如肽類化合物、糖、高聚物、有機酸的鹽、有機金屬化合物等。

場解吸離子化(FieldDesorptionIonization,FD)由場解吸所得的質譜中準分子離子峰強，碎片離子很少，為得到較多的結構信息需進行碰撞導斷裂（collisioninduceddissociation,CID）。場解吸離子化擴大了MS的使用范圍，此法可用于極性大、難氣化以及對熱不穩(wěn)定的化合物，因而在生物活性組分、藥物及其代謝產物或分解產物的研究分析工作中是一種非常重要而且十分有效的分析工具。負離子化學離子化(NegativeIonCI,NICI)負離子化學離子化(NegativeIonCI,NICI)：是在正離子MS的基礎上發(fā)展起來的一種離子化方法，其給出特征的負離子峰，具有很高的靈敏度（10-15g）。只要供試藥物本身或通過衍生化后具有高電子親合能力者，就可選用此法，而且可給出特征的負離子峰?？煸愚Z擊(FastAtomicBombardment,FAB）

快原子轟擊質譜技術（FastAtomBomebard-mentMassSpectrometry,FABMS）是一種軟電離技術，是將樣品溶解于低揮發(fā)性的液體基質中，用高速的中性粒子，如氬、氙等原子來轟擊存在于底物中的樣品，使樣品離子濺出進入分析器而解吸，因之稱為快原子轟擊離子化。這種軟電離技術適于極性強、熱不穩(wěn)定的化合物的分析，特加適用于多肽和蛋白質等的分析研究。FABMS只能提供有關離子的精確質量，從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMS－MS串聯(lián)技術的應用可以提供樣品較為詳細的分子結構信息，從而使其在生物醫(yī)學分析中迅速發(fā)展起來?？煸愚Z擊是80年代以來，被廣為利用的一種軟電離技術。快原子轟擊是利用重的原子如Ar、Xe，將其電離后再加速成為具有較大動能的快速離子，然后在原子槍內進行電荷交換反應，快速離子與靜止的中原子發(fā)生碰撞并進行離子交換，形成中快速原子。原子槍中有一偏轉電極，使未發(fā)生碰撞的快速離子被偏轉引出，快速原子則打在靶上。當快速原子打在含有樣品的基質時，部分能量能導柱品的蒸發(fā)及解離，然后被送入分析系統(tǒng)被測量。常用的基質有甘油、硫代甘油、3-硝基芐醇等，所選擇的基質應具有流動、低蒸汽壓、化學惰、電解質和好的溶解能力。FAB適用于對熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)、高極的有機化合物，如氨基酸、多肽、糖類等。

快原子轟擊質譜技術的特點：可直接進行分析，毋需做成衍生物；可適用于較大分子的MS分析，而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有機化合物的測定。如將FABMS與HPLC聯(lián)用將成為適應力強的分析手段之一。大氣壓化學電離（APCI）

大氣壓化學電離（APCI）：在大氣壓下，化學電離反應速率更大，效率更高，能夠產生豐富的離子。通過一定手段將大氣壓力下產生的離子轉移至高真空處（質量分析器中）。早期為Ni63輻射電離離子源，另一種設計是電暈放電電離，允許載氣流速達9L/S。需要采取減少源壁吸附和溶劑分子干擾。

API是主要應用于HPLC和質譜聯(lián)用時的電離方法。它包括ESI和APCI，兩者都是很軟的電離方法，易于得到樣品的分子量。通過對電壓的調節(jié)，可以得到不同斷裂程度的質譜大氣壓電離是由ESI衍生出來的方法。樣品溶液仍由具有霧化氣套管的毛細管端流出，被氮氣流霧化，通過加熱管時被汽化。在加熱管端進行電暈放電使溶劑分子被電離形成反應離子，這些反應離子與樣品分子發(fā)生離子－分子反應生成樣品的準分子離子。與經典CI不同的，是APCI無須加熱樣品使之汽化，因而應用范圍更廣。由于要求樣品分子汽化，因而APCI主要用于弱極的小分子化合物的分析。二次離子質譜（FAB/LSIMS）二次離子質譜（FAB/LSIMS）在材料分析上，人們利用高能量初級粒子轟擊表面（涂有樣品的金屬鈀），再對由此產生的二次離子進行質譜分析。主要有快原子轟擊（FAB）和液體二次離子質譜（LSIMS）兩種電離技術,分別采用原子束和離子束作為高能量初級粒子。一般采用液體基質負載樣品（如甘油、硫甘油、間硝基芐醇、二乙醇胺、三乙醇胺或一定比例混合基質等）。主要原理是分子質子化形成MH離子，其中有些反應會形成干擾。等離子解析質譜（PDMS）等離子解析質譜（PDMS）采用放射性同位素（如Cf252）的核裂變碎片作為初級粒子轟擊樣品，將金屬箔（鋁或鎳）涂上樣品從背面轟擊，傳遞能量使樣品解析電離。電離能大大高于FAB/LSIMS，可分析多肽和蛋白質。激光解吸/電離（MALDI）激光解吸/電離（MALDI）是在波長為1250-775的真空紫外光輻射產生光致電離和解吸作用，獲得分子離子和有結構信息的碎片，適于結構復雜、不易氣化的大分子，并引入輔助基質減少過分碎裂。一般采用固體基質，基質樣品比為10000/1。根據(jù)分析目的不同使用不同的基質和波長。是新近發(fā)展起來的一種有效離子化技術，能量高、指向性強，因此具有其它能源難以達到的離子化成效，可獲得很強的準分子離子峰。在MS分析中，究竟選用哪一種離子化方式，主要取決于供試物的穩(wěn)定性和揮發(fā)度。基質輔助激光解析電離（MALDI）基質輔助激光解析電離（MALDI）MALDI的工作原理是用小分子有機物作基質，將樣品溶液和基質混合均勻，干燥成為晶體或半晶體后送入離子源內。用一定波長的脈沖式激光照射，基質分子能有效地吸收激光能量，瞬間由固態(tài)轉化為氣態(tài)，基質離子與樣品相互碰撞使樣品離子化，而得以進行質譜分析。常用的基質分子有2,5-二羥基苯甲酸、芥子酸、煙酸、2-氰基,4-羥基肉桂酸等。MALDI特點是準分子離子峰很強，碎片離子峰很少，能直接測定難于電離的樣品，特別是生物大分子物質如多肽、核酸、蛋白等。電噴霧電離（ESI）電噴霧電離（ESI）：采用強靜電場（3-5KV），形成高度荷電霧狀小液滴，經過反復的溶劑揮發(fā)-液滴裂分后，產生單個多電荷離子，電離過程中，產生多重質子化離子。電子噴霧電離質譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)同基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法在固態(tài)下完成不同，電子噴霧電離質譜測量法是在液態(tài)下完成，而且多肽離子帶有多個電荷，由高效液相層析等方法分離的液體多肽混合物，在高壓下經過一細針孔。當樣本由針孔射出時，噴射成霧狀的細小液滴，這些細小液滴包含多肽離子及水份等其他雜質成分。去除這些雜質成分后，多肽離子進入連續(xù)質量分析儀(tan-demmassanalyzer)連續(xù)質量分析儀選取某一特定質量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方式將多肽離子碎裂成不同電離或非電離片段。隨后，依質量/電荷比值對電離片段進行分析并匯集成離子(ionspectrum)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。依據(jù)氨基酸序列進行的蛋白鑒定較依據(jù)多肽質量指紋進行的蛋白鑒定更準確、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通過蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫檢索，也可通過核糖核酸數(shù)據(jù)庫檢索來進行蛋白鑒定。ESI的工作原理是樣品溶液從具有霧化氣套管的毛細管端流出時在電場和霧化氣（通常是氮氣）的吹帶作用下噴成無數(shù)的帶電微液滴，在一定加熱溫度下，液滴中的溶劑被快速蒸發(fā)，液滴直徑不斷變小，表面電荷密度不斷增大。最終使溶劑和樣品離子從液滴中被排擠出，樣品離子進入分析器被檢測。產生的樣品離子可能具有單電荷或多電荷，這和樣品分子中的酸和堿基團數(shù)量有關。通常小分子樣品得到帶單電荷的準分子離子；大分子樣品則得到多種多電荷離子。ESI電離是很軟的電離方法，通常沒有碎片離子峰，只有整體分子的峰。有利于生物大分子的測定。

電噴霧質譜技術與氣相的聯(lián)用技術電噴霧質譜技術是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子而不是碎片離子，使質量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質量也可以根據(jù)質荷比及電行數(shù)算出。電噴霧質譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術聯(lián)合使用，如液一質聯(lián)用（LC－MS）是將液相色譜與質譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質的目的。電噴霧電離質譜（ESI-MS）由于可以產生多電荷峰，與傳統(tǒng)的質譜相比擴大了檢測的分子質量范圍，同時提高了靈敏度，使一種M/Z限制在一定范圍的四極質譜，就可以分析分子質量超過200ku的蛋白質。另外ESI-MS方法產生一系列的多電荷峰，可以得到準確的分子量，它還可與HPLC和高效毛細管電泳（CE）分離方法相連接,擴大了質譜在生物領域的應用。電噴霧發(fā)展過程電噴霧現(xiàn)象的出現(xiàn)可以追溯到兩個世紀之前，但真正把電噴霧作為一種電離方法的創(chuàng)新性的研究是由Dole等在大約30前開始的，他們研究的目的是用電噴霧來產生氣態(tài)大離子。1984年Yamashita等把大氣壓電噴霧電離技術與四極質譜結合起來，同年，Alexandror把它和磁質譜結合起來。1988年Fenn研究小組報道了用ESI-MS得到了帶有45個正電荷分子量為40ku的蛋白質，隨后ESI-MS在生物大分子的研究領域進入了一個全新的發(fā)展階段。到目前為止，該法已經能夠分析質量范圍大約在200ku的蛋白質電噴霧電離過程1．電噴霧電離過程示意圖附圖電噴霧質譜的電離接口示意圖如附圖所示，在毛細管管口加一高電壓，作用于經噴霧頭進入離子化室的溶液，再將3~6kV的電壓加到毛細管和相對的電極之間，電壓導致毛細管末端的液滴表面的電荷增強，高電壓導致液體表面分裂和多電荷液滴的形成，與毛細管子相對的電極攜帶的正或負電荷以產生正或負電荷液滴。對于電噴霧的整體而言，帶電液滴的形成是整個電噴霧過程的第一步，而接下來的離子化是進行電噴霧分析的關鍵。而帶電液滴形成分子離子的機制還不清楚。Iribane和Thomson提出場輔助離子蒸發(fā)假設。在這種模型中，處于液滴表面的離子是由于帶電液滴的溶劑在空氣中蒸發(fā)，當場力在液滴表面達到臨界點時由液相直接進入氣相完成離子化的過程。而Rollgen等提出了不同的假設機理，他認為當液滴在大氣壓下蒸發(fā)時，隨著溶劑的蒸發(fā)，由于液滴直徑變小，液滴表面電荷密度增加，當液滴表面電荷達到雷利極限（Raleighlimit），液滴進一步裂變，再次達到雷利極限，再一次“爆炸”，如此循環(huán)，當溶劑從小液滴中完全蒸發(fā)后形成分子離子。對于大分子化合物離子化過程的形成可用帶電殘渣模型理論加以解釋，該理論認為大分子氣相離子的形成是基于溶劑蒸發(fā)，由庫侖爆裂輔助及較小液滴的相互排斥而導致液滴形成僅含有一個分子離子的氣相離子，此過程所需能量很低，不會導致分子裂解。但是通過離子源內離子傳輸區(qū)的碰撞誘導解離（CID）電壓設置可得到一些有效的碎片離子，但這只對一些不穩(wěn)定結構有效，并且ESI-MS的CID質譜與電子轟擊質譜（EI）及快原子轟擊質譜（FAB）有一定的不同，可能是由于前者的開裂環(huán)境比EI及FAB源更為復雜，因此在對化合物結構的獲得上有一定的制約。隨著現(xiàn)代技術的發(fā)展，電噴霧與串聯(lián)質譜（MS-MS）相連，即能為化合物提供很多結構信息。電噴霧電離質譜用于多肽與蛋白質分析質譜用于分析生物活性分子的研究，靈敏度高，并能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復雜體系中痕量物質的鑒定或結構測定。因此它已經成為解決生命科學中分析研究的重要手段。隨著電噴霧電離技術的廣泛應用，多肽與蛋白質分析近年來取得了相當大的成功。

蛋白質的分子質量的檢測蛋白質的分子質量是一個重要的參數(shù)，而目前常用于測定蛋白質分子量的方法，如凝膠電泳或超速離心法，只有5%的精度，使蛋白質分子質量的估計不可靠。ESI-MS中所形成的多電荷離子可以直接用來準確地和高靈敏度地確定多肽與蛋白質的分子量。電子噴霧最近技術當今社會生命科學蓬勃發(fā)展，特別是隨著基因組計劃的快速、大規(guī)模推進，以及蛋白質組概念的出現(xiàn)，使生命科學的研究開辟了一個嶄新的研究領域，而以ESI-MS