歡迎各位專家蒞臨指導單肺通氣誘發肺損傷時兔肺組織線粒體轉錄因子A表達的變化及烏司他丁的干預效應研究生：XXXXXX導師：教授二級學院：XXXX人民醫院

材料與方法研究目的結論討論結果研究背景目錄Contents我將從以下幾個方面向大家介紹我的研究論文。首先是研究背景單擊研究背景ResearchBackground單肺通氣(one-lungventilation，OLV)的應用已有50多年的歷史，是指患者經支氣管導管僅利用單側肺(非術側肺)進行通氣的方法。主要目的是提供良好的手術視野，避免患側肺對健側肺的污染，減少呼吸運動對手術操作的干擾，隨著外科技術的發展，OLV已廣泛應用于心胸外科及脊柱手術的麻醉。GothardJ.Lunginjuryafterthoracicsurgeryandone-lungventilation.CurrOpinAnaesthesioli,2006,19(1):5-1050

6070

80

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100開胸手術中1h2h3h長時間單肺通氣萎陷側肺快速復張吸入高濃度氧急性肺損傷FiO2：

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手術操作研究背景ResearchBackground細胞內氧自由基增多可介導IL-1、TNF-α等前炎性因子增多，使中性粒細胞募集誘發炎癥反應。中性粒細胞可釋放髓過氧化物酶（MPO），MPO主要功能是利用過氧化氫和氯離子產生次氯酸鹽（HOCl），并形成具有氧化能力的自由基單肺通氣誘發肺損傷的機制研究背景ResearchBackground線粒體是參與細胞能量代謝的重要細胞器，線粒體功能障礙可導致組織缺氧。細胞內氧自由基增多，首先攻擊線粒體基因。線粒體基因（mtDNA）氧自由基RuchkoM,GorodnyaO,LeDouxSP,etal.MitochondrialDNAdamagetriggersmitochondrialdysfunctionandapoptosisinoxidant-challengedlungendothelialcells.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2005,288(3):L530-535線粒體是參與細胞能量代謝的重要細胞器，線粒體功能障礙可導致組織缺氧。細胞內氧自由基增多發生氧化應激反應，主要損傷線粒體基因。線粒體研究背景ResearchBackground線粒體呼吸鏈功能蛋白線粒體轉錄因子A

線粒體轉錄因子A（mtTFA）是mtDNA轉錄翻譯線粒體結構蛋白和功能蛋白的重要啟動子。其高表達可使mtDNA數量增加，對維持mtDNA穩定具有重要意義。mtDNA是轉錄翻譯線粒體呼吸鏈功能蛋白的細胞核外重要遺傳物質翻譯線粒體基因（mtDNA）FukuohA,KangD.MethodsforassessingbindingofmitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM)toDNA.MethodsMolBiol,2009,1760(2):87-101線粒體DNA是轉錄翻譯線粒體呼吸鏈功能蛋白的細胞核外重要遺傳物質，單擊線粒體轉錄因子A是這一復雜過程的重要啟動子之一，其高表達可使mtDNA數量增加，對維持線粒體DNA穩定有重要意義研究背景ResearchBackground細胞核線粒體烏司他丁含有143個氨基酸的糖蛋白，主要通過腎臟代謝,給藥后12h可通過尿和糞便排泄。烏司他丁是分離純化成年男性尿液得到的蛋白水解酶抑制劑。減輕內毒素引起肺損傷InoueK,TakanoH,YanagisawaR,etal.Antioxidativeroleofurinarytrypsininhibitorinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide.IntJMolMed,2005,16(6):1029-1033減輕油酸引起肺損傷JinLY,XuJM,HeZB,etal.[Effectofulinastainontheexpressionofhemeoxygenase-1inoleicacid-inducedacutelunginjuryinrats].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan,2007,32(4):675-678減輕手術操作引起肺損傷JinLY,XuJM,HeZB,etal.[Effectofulinastainontheexpressionofhemeoxygenase-1inoleicacid-inducedacutelunginjuryinrats].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan,2007,32(4):675-678減輕機械通氣引起肺損傷DzierzbickiP,Kaniak-GolikA,MalcE,etal.Thegenerationofoxidativestress-inducedrearrangementsinSaccharomycescerevisiaemtDNAisdependentontheNuc1(EndoG/ExoG)nucleaseandisenhancedbyinactivationoftheMRXcomplex.MutatRes,2012,740(1-2):21-33烏司他丁UlinastainInoueK,TakanoH,YanagisawaR,etal.Antioxidativeroleofurinarytrypsininhibitorinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide.IntJMolMed,2005,16(6):1029-1033烏司他丁是臨床上常用的蛋白水解酶抑制劑，對其結構功能研究較為深入，臨床研究發現，烏司他丁具有減輕內毒素、油酸、手術操作、機械通氣等引起的肺損傷。研究背景ResearchBackground單肺通氣誘發急性肺損傷時肺組織產生

炎癥反應和氧化應激導致線粒體基因受損線粒體功能障礙

是否與mtTFA有關尚不清楚烏司他丁具有減輕肺損傷清除氧自由基和減輕炎癥反應抑制水解酶活性保護線粒體其機制是否與mtTFA有關尚不清楚？？研究背景ResearchBackground材料與方法研究目的結論討論結果研究背景研究目的ResearchObjective

本研究通過建立兔單肺通氣致肺損傷模型，擬探討單肺通氣誘發肺損傷時肺組織線粒體轉錄因子A表達的變化及烏司他丁的干預效應，為臨床防治單肺通氣誘發急性肺損傷提供理論依據。材料與方法研究目的結論討論結果研究背景雙肺通氣組Twolungsvenlilation單肺通氣組Onelungsvenlilation烏

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組UlinastaininterventionU組O組D組動物選擇及分組根據文獻，單肺通氣模型動物種類：材料與方法Materialsandmethods實驗分組本實驗選用國內外研究單肺通氣最常用的動物：新西蘭大白兔根據文獻，單肺通氣動物模型有以下幾種，本實驗選用國內外研究單肺通氣最常用的動物：新西蘭大白兔。單擊選擇健康雄性大白兔24只，單擊采用隨機數字表法，隨機分為3組：雙肺通氣組、單肺通氣組、烏司他丁干預組。單擊健康雄性大白兔24只，體重2.0～2.5kg，常規分籠喂養。由河北醫科大學實驗動物中心提供D組雙肺通氣3h，O組和U組左肺通氣2h后再雙肺通氣1h。通氣參數雙肺通氣時VT為24ml、單肺通氣VT為12ml、FiO2100%，通氣頻率40次/min，I:E為1:2。通氣結束后開胸，取雙側肺尖部組織。模型建立與標本采集D組及O組在通氣即刻靜脈注射等量生理鹽水。U組通氣即刻靜脈注射烏司他丁50kU/kg單肺通氣組Onelungsvenlilation烏

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組Ulinastainintervention雙肺通氣組Doublelungsvenlilation這是我們按照文獻方法自制的雙槍氣管插管單擊D組、O組通氣即刻靜注生理鹽水，U組靜注烏司他丁50KU/kg單擊D組雙肺通·氣3h，O組和U組左肺通氣2h后再雙肺通氣1h。通氣參數設為雙肺通氣時潮氣量為24ml、單肺通氣為12ml、吸入氧濃度100%，通氣頻率40次每分，吸呼比為1:2單擊材料與方法Materialsandmethods自制雙腔氣管插管參照文獻：游志堅,姚尚龍,李進.三種兔單肺通氣模型的比較.中國實驗動物學報,2007,15(4):245-248液氮檢測方法取肺尖部組織裝入凍存管，液氮凍存24h后轉?80℃冰箱保存于通氣開始即刻（T0）、通氣1h（T1）、通氣2h（T2）、通氣結束即刻（T3）采集動脈血取肺尖部組織置入4℃

4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋、切片這是我們的觀察指標及檢測方法。多聚甲醛多聚甲醛化學比色法檢測肺組織SOD活性和MDA含量Westernblot法檢測兔肺組織mtTFA表達免疫組化法檢測兔肺組織mtTFA表達血氣分析動脈血氧分壓，計算氧合指數HE染色觀察肺組織病理學損傷評分觀察指標及材料與方法Materialsandmethods材料與方法研究目的結論討論結果研究背景結果Result各組兔肺組織病理學改變以及肺損傷評分各組兔一般情況比較各時間點氧合指數比較

各組兔肺組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量各組兔肺組織中mtTFA的含量結果分五部分，首先是各組兔一般情況比較單擊各組兔一般情況比較D組、O組及U組兔體重分別為（2.2±0.6）kg、（2.4±0.8）kg及（2.4±0.5）kg，各組兔體重差異無統計學意義（P＞0.05）。

D組、O組及U組兔通氣過程心率為（211±10）次/min、（209±8）次/min及（208±8）次/min，平均動脈壓為（44±4）mmHg、（40±6）mmHg及（39±4）mmHg，各組兔心率、平均動脈壓差異無統計學意義（P＞0.05）。各組兔體重及通氣過程心率平均動脈壓差異無統計學意義。結果ResultComparewithD各時間點氧合指數比較ComparewithT0ComparewithT0結果Result各組兔肺組織SOD活性和MDA含量的比較結果ResultComparewithDComparewithDComparewithleftlungComparewithleftlungComparewithOComparewithOO組右側U組右側各組肺組織病理學結果D組右側O組左側D組左側U組左側400350300250200150100500D組O組U組右肺左肺D組雙側肺組織肺泡結構基本完整，肺泡腔內無明顯滲出、出血、間質增厚、炎性細胞浸潤；O組左側肺組織肺泡結構破壞，肺泡腔內少量滲出物，少量出血，間質輕度增厚，炎性細胞浸潤較少。O組右側肺組織大部分肺泡結構消失，肺泡腔內有滲出較多，出血多，間質明顯增厚，炎性細胞較多；U組左右側肺組織比O組左右側肺組織損傷程度輕。將上述圖片進行根據病理損傷評分，得出數據顯示：長時間單肺通氣肺組織mtTFA表達下調。2、烏司他丁具有減輕單肺通氣損傷，與上調肺組織mtTFA表達有關1、長時間單肺通氣肺組織病理學損傷評分升高。2、與單肺通氣組比較，烏司他丁組肺組織病理學損傷評分下降。結果Resultcomparewithlunginjuryscoresingroups結果表明：與D組相比，O組肺組織mtTFA表達降低；

與O組肺組織相比較，U組肺組織mtTFA表達升高O組右側U組右側D組右側O組左側D組左側U組左側400350300250200150100500D組O組U組左肺右肺免疫組化法測定各組肺組織mtTFA表達結果ResultWesternblot結果以密度掃描分析：采用美國Bandscan5.0軟件對Westernblot結果進行定量分析，灰度值以累積光密度值（IOD）表示，結果通過以下公式計算：mtTFA蛋白累積光密度值GAPDH的累積光密度值

mtTFA蛋白半定量=DLDROLORULURWesternblot法檢測各組肺組織mtTFA表達mtTFA表達GAPDH

結果表明：與D組相比，O組肺組織mtTFA表達降低；

與O組左側肺組織相比，O組右側肺組織mtTFA表達降低；

與O組肺組織相比較，U組肺組織mtTFA表達升高。

與免疫組化法測定mtTFA結果一致。D組O組U組結果Result左肺右肺

TheexpressionleveloflungtissuemtTFAwasmeasuredbywesternblotindifferentgroups.材料與方法研究目的結論討論結果研究背景研究表明，氧合指數<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)時即可認為發生肺損傷。O組、U組通氣結束時氧合指數<300mmHg，提示氧飽和下降，出現輕微的低氧血癥。光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結構消失，肺泡腔內有滲出，出血多，間質增厚，炎性細胞大量聚集。綜合肺組織病理學結果及血氣分析結果，O組、U組通氣結束時氧合指數<300mmHg，氧飽和下降，出現輕微的低氧血癥，提示兔單肺通氣誘發肺損傷模型制備成功。烏司他丁減輕肺損傷機制

肺損傷時肺組織脂質過氧化反應及與mtTFA關系單肺通氣致肺損傷的機制單肺通氣誘發肺損傷模型的制備討論

Discussion動脈血氧合指數比較：O組、U組通氣結束時氧合指數<300mmHg，提示氧飽和下降，出現輕微的低氧血癥。肺組織病理學損傷評分：光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結構消失，肺泡腔內滲出，出血多，間質增厚明顯，炎性細胞聚集。研究表明，氧合指數<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)時即可認為發生肺損傷。

本研究結果表明：O組、U組通氣結束時氧合指數<300mmHg，提示通氣結束時氧飽和下降，出現輕微的低氧血癥。根據文獻，對肺泡結構、肺間質水腫增厚、肺泡內滲出、出血、炎性細胞浸潤程度進行評分，>3分為重度損傷本研究結果表明，光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結構消失，肺泡腔內滲出，出血多，間質增厚明顯，炎性細胞聚集。單肺通氣誘發肺損傷模型的建立討論

Discussion研究表明，氧合指數<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)時即可認為發生肺損傷。本研究結果表明，O組、U組通氣結束時氧合指數<300mmHg，提示氧飽和下降，出現輕微的低氧血癥。

根據文獻，對肺泡結構、肺間質水腫增厚、肺泡內滲出、出血、炎性細胞浸潤程度進行評分，>3分為重度損傷光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結構消失，肺泡腔內有滲出，出血多，間質增厚，炎性細胞大量聚集。綜合肺組織病理學結果及血氣分析結果，O組、U組通氣結束時氧合指數<300mmHg，氧飽和下降，出現輕微的低氧血癥，提示兔單肺通氣誘發肺損傷模型制備成功。單肺通氣誘發肺損傷模型制備成功單肺通氣誘發肺損傷機制

單肺通氣誘發非通氣側肺損傷比通氣側嚴重本研究結果表明，與O組左側比較，O組右側肺組織肺損傷評分升高、SOD活性降低、MDA含量升高、mtTFA表達下調。提示非通氣側肺組織損傷嚴重，其機制可能為非通氣側肺組織長時間萎陷，肺泡Ⅱ型細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性較肺通氣側明顯下降，阻礙肺泡間質內的肺水重吸收，因此肺泡內滲出液增多。單肺通氣轉為雙肺通氣時，產生的界面切力和肺水滯留，是引起非通氣側肺組織受到牽張而損傷嚴重的重要原因。肺快速復張時，可造成膨脹和不張肺組織的交界處產生:界面切力肺水滯留討論

Discussion單肺通氣誘發肺損傷機制本研究結果表明，與D組比較，O組肺組織SOD活性下降，MDA含量增加，提示單肺通氣致肺損傷時兔肺組織發生氧化應激反應。其機制可能為：炎性起始的中性粒細胞募集，釋放MPOMPO介導釋放TNF-αIL-1中性粒細胞募集髓過氧化物酶討論

DiscussionMPOMPOMPOMPOMPOMPO細胞超微結構模擬示意圖線粒體轉錄因子A（mtTFA）線粒體環狀DNA（mtDNA）O2-線粒體超微結構模擬示意圖細胞核內DNA組蛋白減輕炎癥反應清除氧自由基防止細胞鈣超載抑制水解酶的活性研究表明烏司他丁烏司他丁是分離純化成年男性尿液得到的蛋白水解酶抑制劑。烏司他丁覃建明.烏司他丁的藥理作用及臨床應用進展[J].中國醫藥導報,2008,(11):19-20譚朝華,徐軍美,楊昭云,楊東林,呂志平.烏司他丁對急性肺損傷兔炎性細胞因子及氧自由基的影響.中國醫師雜志,2004,(10):1360-1362.討論

Discussion烏司他丁calciumoverload防止鈣超載Inflammatoryreaction減輕炎癥反應hydrolaseactivi