一、實驗目的掌握微生物常規培養基的制備方法學習無菌技術

學習玻璃器皿的包扎實驗四微生物培養基的配制與無菌技術

二、實驗內容1、6種培養基的配制牛肉膏蛋白胨培養基（細菌）高氏一號培養基（放線菌）馬丁氏培養基（真菌）淀粉培養基（淀粉水解試驗）蛋白胨水培養基（吲哚試驗）葡萄糖蛋白胨水培養基（V.P試驗）2、移液管、培養皿、三角瓶、試管等的包扎3、滅菌實驗四微生物培養基的配制

無菌水的準備三、實驗原理培養基medium:用人工的辦法將多種營養物質按微生物生長代謝的需要配制成的營養基質。水、C源、N源、礦物質、生長因素/因子、微量元素培養基種類：天然培養基、合成培養基、半合成培養基固體培養基、液體培養基、半固體培養基基礎培養基、加富培養基、選擇性培養基、鑒別培養基實驗四微生物培養基的配制

四、實驗步驟配制培養基的流程：原料稱量、溶解調節pH值(加瓊脂熔化)(過濾)定容分裝塞棉塞/扎口滅菌

培養基分裝裝置

斜面擺放法

棉塞的做法a)棉塞的制作過程(b)正誤棉塞培養皿的包扎五、無菌技術在(利用微生物)進行研究實驗或生產過程中，采用物理和化學的方法技術，保證培養物不受環境微生物的污染，同時也不允許操作的微生物擴散到環境中去。如高溫滅菌、過濾、紫外線照射處理等。五、無菌技術滅菌與消毒滅菌Sterilization：用物理或化學的方法來殺死或除去材料上或環境中的所有微生物的處理。消毒Disinfection：用物理或化學的方法殺死物體上絕大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生物）的處理。消毒實際上是部分滅菌。防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質上的生長化療(Chemotherapy)：殺死或抑制宿主體內的病原微生物抑制(Inhibition)：生長停止，但不死亡死亡(Death)：生長能力不可逆喪失常用的滅菌方法干熱滅菌熱蒸汽滅菌常壓滅菌過濾除菌射線滅菌化學藥物滅菌1、火焰滅菌微生物接種工具如接種環、接種針或其它金屬用具等可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進行滅菌。這種方法滅菌迅速徹底。接種過程中，試管或三角瓶口等，也可通過火焰灼燒滅菌。2、干熱滅菌用干燥熱空氣（160℃,1~2h）殺死微生物培養皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接種、鑷子、剪刀等能耐高溫的器皿晾干后用牛皮紙包好溫度升到100℃，開箱內鼓風機培養基、橡膠塑料制品不能用此方法注意安全干熱滅菌箱鼓風鈕溫度調節器指示燈溫度調節旋扭溫度計與排氣孔3、濕熱滅菌常壓蒸汽間歇滅菌將待滅菌的培養基或物品裝入常壓滅菌器內，加熱至100℃大量產生氣體時,維持30—60min,每天滅菌一次,連續滅菌三天.每次蒸煮間隙里,培養基或物品應放在室溫(20--30℃)條件下培養,第一次蒸煮殺死微生物的營養體,芽孢則在培養過程中萌發成營養體;第二次蒸煮即可殺死.經過二次培養,三次反復蒸煮,即可達到完全滅菌。常壓蒸汽持續滅菌高壓蒸汽滅菌3、濕熱滅菌常壓蒸汽間歇滅菌常壓蒸汽持續滅菌常壓蒸汽持續滅菌中,從蒸汽大量產生開始,繼續加大火力保持充足蒸汽,持續加熱3—6h,殺死絕大部分芽孢和全部營養體,達到滅菌目的。高壓蒸汽滅菌3、濕熱滅菌高壓蒸汽滅菌原理：水的沸點隨壓力的增加而提高。水在密閉的加壓蒸汽滅菌器中煮沸，產生蒸汽驅除鍋內冷空氣后，使蒸汽不能逸出，因而增加了鍋中的蒸汽壓力。蒸汽壓力提高，水的沸點隨著上升，因而能夠獲得比100℃更高的蒸汽溫度，用來進行有效的滅菌。同一溫度下，濕熱滅菌法比干熱滅菌法效果好蒸汽穿透力強蛋白質含水量高，易于凝固手提式滅菌鍋安全閥壓力表放氣閥軟管緊固螺栓滅菌桶篩架水臥式滅菌鍋

是指含菌液體或氣體通過細菌濾器，使雜菌留在濾器或濾板上，從而除去雜菌。常用于許多不宜用濕熱滅菌的液體物質，如抗生素、血清、糖類溶液等。用于除菌的細菌過濾器，是由孔徑極小，能阻止擋的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成.為了加快過濾,一般多采用抽氣減壓的方法,進行操作。4、過濾除菌過濾除菌

輻射滅菌(RadiationSterilization)是利用電磁輻射產生的電磁波殺死大多數物質上的微生物的一種有效方法。用于滅菌的電磁波有微波，紫外線(UV)、X-射線和γ-射線等。5、射線滅菌酚類——損傷微生物細胞壁和細胞膜、酶鈍化、蛋白質變性

醇類——溶解膜中的類脂，破壞膜結構，使蛋白變性（純的或高濃度酒精使菌體表面蛋白凝固，使乙醇不易滲進細胞）

醛類——與蛋白質中氨基酸的多種基團共價結合而使其變性酸類——抑制微生物酶和代謝活性

表面活性劑——改變細胞的穩定性和透性，細胞物質逸出鹵化物——與細胞中的酶和蛋白質中的酪氨酸結合，Cl2和漂白粉產生次氯酸和新生態氧（強氧化劑），破壞細胞膜結構6、化學藥劑消毒或滅菌作用機理：重金屬——與酶或蛋白質上的—SH結合

氧化劑——使細胞成份氧化

染色劑——堿性染料的陽離子基團與蛋白質氨基酸上的羧基或核酸上的磷酸基結合，阻礙正常代謝

抗生素——多種機理：作用于細胞壁、膜、蛋白質、核酸等大分子合成抗代謝物——競爭抑制，如磺胺類藥物于對氨基苯甲酸類似，阻止葉酸的合成6、化學藥劑消毒或滅菌作用機理：墻壁光滑，地面平坦，避免積累灰塵，便于清洗消毒；不裝風扇，通風換氣通過空氣調節裝置使用前，用2%新潔爾敏擦洗再用75%酒精（或5%石炭酸）噴霧，使灰塵落下最后用紫外燈照射約20min定期熏蒸：一年二~四次（細菌、真菌培養基檢驗）

用40%甲醛（6~10ml/m3)或加半量高錳酸鉀熏蒸，盛于鐵制容器，電爐或酒精燈加熱（應能隨時終止熱源），熏蒸后密閉12h以上，使用前1~2h用氨水中和。其他熏蒸劑；乳酸（對細菌）、硫磺無菌室消毒升汞（0.1%

HgCl2）漂白粉10g/150mlNaClO（2-10%）酒精75%苯酚（1%）福爾馬林（5%）過氧化氫（3%）氰化汞（0.1%）高錳酸鉀（2%）硝酸銀(0.1%)常用表面消毒劑酸性培養基:如10ml培養基中加三滴25%的乳酸

孟加拉紅：0.035g/L培養基抗菌素:金霉素（30μg/ml）可抑制多數細菌;青霉素（20μg/ml）可抑制G+細菌;多粘霉素（5.0μg/ml）可抑制G-細菌;鏈霉素(40μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)可抑制大部細菌.

除氯霉素可滅菌前加入外，其它抗菌素都是在培養基滅菌后并冷卻到45℃左右時加入.