《醫學免疫學》實驗二

實驗內容一、淋巴細胞轉化實驗（操作一）MTT法二、酶聯免疫吸附試驗（操作一）ELISA（雙夾心法）法檢測乙肝表面抗原（HBsAg）

一、淋巴細胞轉化實驗

（MTT法操作一） 原理方法結果應用MTT法——

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法

原理：T淋巴細胞在有絲分裂原刺激下，發生有絲分裂，形成淋巴母細胞。其蛋白質合成與DNA合成及代謝比正常細胞旺盛，活細胞線粒體中某些酶可將MTT還原為藍黑色甲臜．用ＤＭＳＯ溶解甲臜，在５７０nm處測ＯＤ值，能夠反映Ｔ淋巴細胞的增殖轉化程度．MTT法活/增殖期的細胞線粒體能量代謝琥珀酸脫氫酶MTTMTT摻入還原甲臢顆粒formazan細胞內/周圍溶解測OD值MTT-四甲基偶氮唑鹽絲裂原MouseHumanTBTBConA++++-PHA+-++-PWN++++/-LPS-+--SpA---+實驗步驟無菌取1/2的脾研磨成單細胞懸液細胞計數(40×)96孔培養加板(三復孔)調細胞濃度1×107/ml5%CO237℃培養44小時加入MTT(5mg/ml)10ul/well5%CO237℃繼續培養4小時輕輕吸去上清，加DMSO，溶解甲臜顆粒A570nmELISAplatereader實驗組加入不同濃度ConADay1Day3注意事項:由于本實驗需要培養3天，才能觀察結果。因此，在操作時應注意無菌操作，避免細菌污染，導致實驗的失敗。實驗步驟：(本次課完成)1、制備脾細胞懸液1）取脾：用1000ul加樣器取5ml培養液放入平皿中.頸部脫臼處死小鼠，酒精消毒，無菌取脾臟，用毛玻璃片磨碎，放在平皿中，隔著紗布吸出細胞懸液放入離心管中，離心1500r/min,20min。棄去上清,加入3mlIMDM培養液，混勻。2）細胞計數：取0.2ml

放入一試管中,加入1.8ml細胞計數液。取20ml填充細胞計數板,顯微鏡下計數。計數方法>>。

3）調細胞濃度到5×10６/ml：如配制10mL稀釋細胞懸液:從細胞懸液中取(2000/X)mL至試管,加入培養液至10ml即可。細胞計數方法細胞計數方法l查出四個16個大方格的總細胞數(X)l算出每個大方格的細胞數：Y=X÷4l每個大方格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4mll制備的細胞懸液的細胞濃度（A/ml)=Y×104×稀釋倍數(10)4××實驗步驟（本次課完成）2、加板每孔加入100ml的調好的細胞懸液1-3孔(對照)加入10%FCS-IMDM100ml4-6孔加入20mg/ml的ConA100ml7-9孔加入10mg/ml的ConA100ml10-12孔加入5mg/ml的ConA100ml3、細胞培養：5%CO2孵箱內37℃培養48h。4、MTT摻入：在終止培養前4小時（培養44小時）加入MTT(5mg/ml)10ml/孔，繼續培養，至48小時終止培養(此步驟由實驗小組長完成)。實驗步驟：(下次課完成)5、結果測定：棄上清，加入DMSO(100ml/孔)，振蕩溶解甲臢顆粒。充分溶解后用酶標儀測定其吸光度值。OD570nm。形態學淋巴母細胞在形態學上的表現主要有體積明顯增大，是成熟淋巴細胞的3~4倍；染色質疏松，核仁清晰可見；胞漿豐富并形成空泡。根據細胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結構以及有無核仁等特征，分別計數淋巴母細胞、過渡型母細胞和核絲分裂相細胞以及成熟的小淋巴細胞，以前三者為轉化細胞，每份標本計數200個細胞，按下式計算轉化率：淋巴細胞轉化實驗的應用 檢查患者細胞免疫功能估計疾病的療效及預后細胞配型抗原的檢查：移植免疫－MLR免疫藥理學：具有免疫調節的藥物、保健品、中草藥及生物制品衛生毒理學的研究二、ELISA（雙夾心法）法檢測乙肝表面抗原（HBsAg）

【目的】1.掌握酶聯免疫吸附試驗的原理。2.熟悉ELISA的基本類型和用途。3.掌握用酶聯免疫吸附試驗雙抗夾心法檢測乙型肝炎表面抗原的方法。【實驗原理】先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗體；加入待檢標本，充分作用后，標本中相應的抗原與固相上已知抗體結合，洗去未結合的抗原成分；加入已知的酶標抗體，再洗去未結合的酶標抗體；加底物后，酶分解底物產生呈色反應，根據顏色的深淺判定待檢標本中抗原的量。固相載體最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。Enzyme常用的酶辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)。葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP的底物鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)四甲基聯苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)OPDOPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色

返回>>ApplicationofELISA目前應用最廣泛的免疫學檢測技術之一，常用來檢測機體的可溶性的抗原或抗體。敏感性高，可檢測微量的的抗體體或激素、細胞因子及粘附分子等抗原性物質。成品的試劑盒，已廣泛用于某些臨床疾病的診斷。返回>>常用的ELISA方法直接法(DirectELISA)間接法(IndirectELISA)夾心法(SandwichELISA)直接法間接法夾心法【材料與試劑】1．材料：酶標板（96孔）、微量加樣器、酶標檢測儀、濕盒、水浴箱，43℃培養箱2．試劑：1）包被抗體：抗HBs(用包被緩沖液稀釋2ug/ml)2）酶標抗體（HRP—抗HBs,用洗滌液稀釋1:300）3）HbsAg表面抗原（乙肝疫苗,用樣本稀釋液稀釋1600ng/ml即1.6ug/ml）4）模擬待檢樣品（HBsAg疫苗,用樣本稀釋液稀釋400ng/ml即0.4ug/ml）5）包被緩沖液pH9.6\0.05mol/L碳酸鹽緩沖液。6）洗滌液0.01MpH7.4PBS含0.1%Tween20（不含任何防腐劑）。7）封閉液：0.01mol/L、PH7.4PBS內含1%BSA,。8）樣品稀釋液含0.25%BSA-洗滌液。9）底物緩沖液（pH5.0）0.2MNa2HPO425.75ml+0.1M檸檬酸24.25ml+30%H2O2100μl。10）底物溶液鄰苯二胺(OPD)1mg/ml溶于底物緩沖液中，臨用前配制。11）終止液2mol/LH2SO4（22ml濃H2SO4+178mldH2O）。【實驗學時】2.5學時，分兩次課完成。【實驗步驟】第一次操作，用時25分鐘1、抗體包被：用包被液將抗HBs稀釋至適當濃度（2ug/ml），酶標板中1~10孔每孔加100μl，11~12做空白對照（不加樣）,將反應板移至溫盒內，4℃放置過夜（可保存一周，下次課后續操作）。第二次操作，下次課完成，用時100分鐘2、封閉：棄去包被液，每孔加入200ul封閉液，11~12孔空白對照,置43℃溫箱20min。3、洗滌：棄去包被板孔內液體，用洗滌液注滿1~10孔，靜置1~3min后甩干，洗滌1次，于吸水紙上拍干。4、加樣：1-2、4-8每孔加樣品稀釋液100μl，3、4孔加1.6ug/mlHbsAg表面抗原，100ul/孔，自第4孔混勻后吸出100ul加入第5孔，以此方法對倍稀釋至8孔,吸出100ul棄之,9\10孔加入待檢樣品100ul/孔,輕輕振動混勻置于43℃20min，棄去孔內液體，用洗滌液洗滌3次，每次1~3分鐘,拍干。5、加酶標抗體：每孔加HRP—抗HBs100μl（空白孔不加），置于43℃20min