植物組織培養技術1緒論組培是二十世紀發展起來的新技術，近四十年來發展極為迅速，幾乎以植物為研究對象的各個分支學科都在廣泛進行組織培養。

1902年，德國植物學家Haberlandt

根據細胞學說提出細胞全能性（totipotency）理論。初步成功：1904年Hanning

最先成功培養了蘿卜和辣根菜的胚→開始大量實驗，技術逐步完善→1960年“蘭花工業”巨大利潤沖擊→促使新一輪研究熱潮興起→奠定新興獨立學科→植物組織培養學。

目前達到的水平：從任何植物器官、組織、細胞甚至沒有細胞壁的裸露原生質體中再生小植株。在這一技術基礎上各國競相投資，在快繁、脫毒、育種、次生代謝物生產、種質資源的保存方面取得了巨大的社會、經濟、生態效益。第一章植物組培的基本理論

第一節植物組培的概念

一.概念

廣義：離體條件下利用人工培養條件在無菌情況下培養、生長、發育再生出完整植株的過程。

狹義：將離體植物器官、組織、細胞和原生質體培養在人工配置的培養基上，給予適當培養條件，使細胞增殖或誘導長成完整的植株。根據外植體來源又分：

（一）按培養對象可分：

1.植株培養：是對完整植株材料的培養，如幼苗及較大植株。

2.器官培養：離體器官的培養，根據作物和需要不同，包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體培養。

3.組織或愈傷組織培養：為狹義組織培養，對植物體各部分組織進行培養，如莖尖分生組織、形成層、木質部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等；或對由植物器官培養產生的愈傷組織進行培養，二者均通過再分化誘導形成植株。

4.細胞培養：對由愈傷組織等液體振蕩培養得到的，能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞，或很小的細胞團的培養。

5.原生質體培養：用酶及物理方法除去細胞壁的原生質體的培養。

（二）根據培養條件可分：液體培養、固體培養、半固體培養、光培養、暗培養二.常用名詞的解釋

1.愈傷組織(callus)：在培養基上由外植體形成的一團無序生長的薄壁細胞。

器官發生→植株胚狀體發生→人工種子、轉基因材料外植體→愈傷組織懸浮細胞培養→次生代謝物培養原生質體培養→細胞融合

2.外植體(explant)：由植物體取下接種在培養基上的無菌細胞、組織、器官等。

特點：多細胞，組成細胞類型不同，形成愈傷組織有異質性，不同組分細胞具有不同的形成完整植株的能力，即再分化能力。幾十年來人們廣泛嘗試不同材料作外植體，如Haberlandt用葉肉細胞、髓細胞、腺毛、雄蕊毛、氣孔保衛細胞。由于對細胞性質和條件摸索不夠均未成功。基本上用薄壁組織，成熟組織如機械組織、輸導組織、分泌組織不易成功（如山西農科院用果柄。復習組織類型）

適宜的外植體材料：薄壁細胞、形成層。

不適宜的外植體材料：成熟組織不宜，如瓜皮、果柄。

第二節植物組織培養的理論基礎一.植物細胞的全能性（totipotent)

概念:植物細胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發育成完整植物體的潛在能力。植物細胞只要有完整膜系統和有生命力的核，即使已高度成熟分化，還保持回復到分生狀態的能力。

原理：生物體每個細胞都含有該物種全套遺傳物質，有發育成為完整個體所必需的全部基因，理論上講，每個活細胞都具有全能性。差異：1.受精卵全能性最高。受精卵－胚－種子－幼苗－植株，即說明全能性；2.受精卵分化后，體細胞的全能性比生殖細胞低。

體細胞從合子的有絲分裂產生，也具全能性，有遺傳信息的傳遞、轉錄和翻譯能力。完整植株上某一部分體細胞只表現一定形態，承受一定功能，是受具體器官或組織所在環境束縛，其遺傳潛質并沒消失，一但脫離束縛，條件適宜即表現全能性。

潛在全能性原因：基因表達的選擇性。處于離體狀態的植物活細胞，在一定營養物質、激素和外界條件作用下，即可表現出全能性。人工條件下實現這一過程，就是植物組織培養。

二.植物細胞全能性表達不少植物繁殖就是通過根莖葉等器官再分化而成，如扦插繁殖，原因：受傷組織--創傷激素--促使周圍組織生長--愈傷組織--內源激素促使儲存營養--新器官。

植物組培技術擴大此項功能，使植物的范圍、再生部位均擴大。自然條件下營養器官和細胞再生困難，是內源激素調整緩慢或不全面，外界條件不易控制。組培在人工控制條件下通過調整培養基，特別是對激素成分調整，有可能順利實現。

分化：胚性細胞幾乎無差異。隨種子萌發，細胞分裂分化為根莖葉等器官--逐漸失去分裂能力，形態結構及功能發生永久性適應變化的過程，即--。

原因：由基因決定。基因在時空上差次表達的結果。

結果：細胞分裂能力喪失，通常不會恢復直至死亡。脫分化：已分化的、停止分裂的細胞，從植物體部分抑制性影響下解脫出來，恢復分裂活性。把成熟細胞放到培養基上，即發生恢復分裂能力的現象。溶酶體分解失去功能細胞質--酶活使蛋白質合成代謝改變--基因表達改變--返老還童。

再分化：脫分化的組織或細胞（愈傷組織）在一定培養條件下，可有轉變為各種不同細胞類型的能力。

已分化的細胞表達全能性必須經脫分化、再分化，即細胞培養目的：設計培養基、創造培養條件即組培目的。原則是如何使細胞完成脫分化和再分化，主要工作為設計、篩選培養基；探索建立合適的培養條件，摸索植物激素的主要作用。三.外植體離體分化過程的類型

1.無菌短枝型也稱節培法或微扦插。將待繁殖材料剪成帶一葉的單芽莖段轉入成苗培養基，一定時間后可成苗，再剪成帶一葉的單芽莖段，繼代又可成苗。

特點：一次成苗，遺傳穩定，過程簡單，適用范圍大，移栽易成活。試管繁殖常用，也是其他方法最后階段常用方法，但初期繁殖速度慢。

2.叢生芽增殖型莖尖或初代培養的芽在適宜培養基上誘導，不斷發生腋芽而成叢生芽，再轉入生根培養基誘導生根成苗，擴大繁殖。

特點：從芽到芽，遺傳穩定，繁殖速度快，是莖尖培養和脫毒苗初期必由之路。但過程復雜，品種差異大。

3.愈傷組織再分化，有兩種方式：

A.不定芽：指愈傷組織培養物，通過形成不定芽再生成植株，這是細胞和組織培養中常見的器官發生方式。愈傷組織的器官發生順序：

（1）愈傷組織有根或芽的分別形成，即無根的芽或無芽的根；（2）先形成芽，芽伸長后在莖基長出根，形成小植株。多數植物屬此；（3）先產生根，再從根基部分化出芽，形成小植株。較難誘導芽形成，尤其單子葉；（4）先在愈傷組織鄰近部位分別形成芽和根，然后結合形成小植株。

B．胚狀體：由培養細胞誘導分化出的胚芽、胚根、胚軸的胚狀結構而植株

4.原球莖型第三節植物組培技術的特點

一.培養條件可以人為控制組織培養采用的植物材料，完全在人為提供的培養基質和小氣候環境條件下生長，擺脫大自然四季、晝夜變化及災害性氣候影響。條件均一，對植物生長極為有利，便于穩定、周年培養生產。

二.生長周期短，繁殖率高

組培是人為控制培養條件，根據不同植物不同部位不同要求提供不同培養條件，因此生長快。另外植株比較小，往往20-30d為一周期。所以，雖然有設備及能源消耗，由于材料能按幾何級數繁殖，總體來說成本低廉，且能及時提供規格一致的優質種苗或脫病毒種苗。

三.管理方便，利于工廠化生產和自動化控制

組培是在一定場所和環境下，人為提供溫度、光照、濕度、營養、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產，也利于自動化控制生產。是未來農業工廠化育苗的方向。與盆栽、田間栽培相比，省去中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等系列繁雜勞動，可節省人力、物力及田間種植所需要土地。四.植物組織培養的材料經濟

取材少，培養效果好，對品種推廣及復壯均有意義。非洲紫羅蘭一枚葉片，三個月可得5000株苗。第二章植物組培的發展和應用

第一節發展簡史

一.植物組織培養的探索階段

1838-1839年，德國科學家Schleide

和Schwann發表了細胞學說，奠定組織培養理論基礎。

1902年，德國植物學家Haberlandt

根據細胞學說，提出單個細胞的植物細胞全能性（totipotency）理論。

1904年，Hanning

最先成功地培養了蘿卜和辣根菜的胚。

1922年，Knudson采用胚培養法獲得大量蘭花幼苗。

1934年，White用番茄根尖建立起第一個活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養首先獲得成功。

二.植物組織培養的技術建立階段

1933年李繼侗培養銀杏離體胚（3mm的胚），添加胚乳、種子、果實提取物。

1934年美國White由番茄根建立第一個無性繁殖系，28年繼代1600代。并研究光、溫度、通氣、pH值、培養基組成的影響，于1937年建立第一個綜合培養基，定名為White培養基。

1934年Gautherer提出B族維生素和生長素的作用，于1939年培養胡蘿卜根形成層獲成功。同年White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜建立連續生長的培養物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起譽為組培學科奠基人。現在所用培養方法和培養基，基本由這三位科學家建立。

1943年White發表《植物組織培養手冊》，使組培成為新興學科。

40年代Skoog和崔徵明確腺嘌呤與生長素比例是控制芽根形成的主要條件。比例高-芽，低-根；相等則不分化。

1956Miller等人發現激動素可代替腺嘌呤，效果可增3萬倍。上述模式變為激動素與生長素比例。這一發現有力推動組培發展。

1952年Morel和Martin首次獲得無病毒植株。

1958年，英國科學家Steward等用胡蘿卜根愈傷組織細胞懸浮培養，成功誘導出胚狀體并分化為完整植株，使細胞全能性理論得到證實，且為組培技術程序奠定基礎。三.植物組培的迅速發展階段

1960年，Morel提出離體無性繁殖蘭花，繁殖系數極高。被蘭花生產者所采用，迅速建立起蘭花工業。

1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質體獲成功。

1971年，Takebe等用煙草原生質體獲再生植株，不僅理論上證明無壁的原生質體同樣具有全能性，且在實踐上為外源基因導入提供理想受體。80年代中期以來，對禾谷類原生質體培養相繼告捷，中國學者做出重要貢獻。

1962年，Murashinge和Skoog

在煙草中篩選出仍被廣泛使用的MS培養基。

1964-1