1植物分子生物學實驗技術2主要內容第一部分核酸的分離制備第二部分PCR技術第三部分主要分子標記第四部分基因克隆3（美）DvekslerGSandDieffenbachCW.黃培堂俞煒源陳添彌等譯現代生物技術譯從PCR技術實驗指南科學出版社（英）ClarkMS主編顧紅雅瞿禮佳主譯植物分子生物學實驗手冊高等教育出版社施普林格出版社鄭成木主編植物分子標記原理與方法湖南科學技術出版社BrownTA.魏群等譯國外優秀生命科學教材譯從基因克隆和DNA分析高等教育出版社參考書目：4第一部分：核酸的分離制備abc???5第一部分：核酸的分離制備DNA提取是一切分子生物學研究最基礎的技術，高質量的DNA是用于PCR和酶切分析等系列后續操作的重要保證發展了多種DNA提取方法,可從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實、韌皮部等多種組織器官中提取DNA；但不同植物、同種植物材料的不同來源、部位、形態以及不同化學成分、組織結構特點差異,導致DNA

提取時需要選擇不同的方法或作一些特殊處理

從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質的木本植物中提取DNA的方法難度就相對大于大多數禾谷類及蔬菜類植物（1）多酚被氧化成棕褐色（2）多糖、單寧等物質與DNA會結合成粘稠的膠狀物,獲得的DNA常出現產量低、質量差、易降解，影響了DNA質量和純度，不能被限制性內切酶酶切，嚴重的甚至不能作為模板進行PCR擴增1.DNA在分子生物學研究中的重要性62.提取DNA應滿足的基本原則不同的研究對DNA的要求不一致，但一般應滿足:(1)排除蛋白、糖類和脂類等物質的污染，DNA純度應滿足下游操作需要用于RFLP、AFLP應滿足酶切要求用于PCR的不含PCR的干擾甚至抑制物

(2)所得DNA應當完整電泳檢測得到清晰、完整、可重復、無降解的條帶保證DNA一級結構的完整

(3)足夠量的DNA

有的實驗要求量多（標記）7(1)破壞（消化）細胞壁、釋放內容物在破壁時也會剪切DNA，在完整性和產量間折衷考慮分離總DNA破壁方法液氮中快速冷凍、研磨成細粉末分離核DNA或細胞器DNA破壁方法更溫和的方法、以免過早破壞內膜系統、含滲透劑的緩沖液4oC勻漿

(2)破壞細胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中通常靠SDS或CTAB去污劑來完成，保護DNA受核酸內源酶降解緩沖液通常含EDTA，可螯合大多數核酸酶所需要的輔助因子-鎂離子3.基本原理8（1）植物材料的采集及前處理

盡可能使組織材料保持水分而保鮮（用濕紗布包裹,放置于密閉的冰盒等）野外遠距離采集樣本時，盡可能采用冷凍保存(如放置于液氮中)

不具備冷凍條件時無水CaSO4的瓶子分別保存使其迅速干燥，可將材料保存數月，返回后盡快提取DNA

對具有大量次生代謝物(如丹寧、酚類、醌類等)的植物材料,盡可能采集幼嫩組織，冷凍保存、短時間內提取DNA

植物組織化學保存法乙醇、丙二醇處理法導致DNA劇烈降解（不推薦）

樣品長期保存液氮處理后貯存在-80℃冰箱或直接儲放于液氮中

在與提取緩沖液接觸前防止冰凍樣品在空氣中融化導致酚類易被氧化

實驗室發苗、田間取葉片（清洗去除灰塵、泥土以及菌孢子等）

饑餓處理減少淀粉含量、遮光處理產生黃化苗4.基本步驟9（2）組織（細胞）破碎物理方法溶漲和自溶;化學方法生物酶降解液氮快速冷凍處理后研磨（推薦）或在提取緩沖液中研磨（不推薦）（3）釋放DNA

釋放DNA到CTAB或SDS類去污劑中、65oC保溫處理（4）純化和濃縮：去除殘渣、沉淀DNA

釋放出的DNA中含有大量的RNA、蛋白質、多糖、丹寧和色素等雜質需用氯仿、苯酚處理后變性、沉淀除去，RNA可用RNase除去。通常采用4oC離心的方法，產生分層，去掉植物殘渣、留上清液部分沉淀通常采用異丙醇（1volume)、酒精（2volume)等（5）洗滌去掉部分色素和鹽等，通常采用70%酒精和100%無水乙醇4.基本步驟10（6）DNA純度和濃度檢測

0.8%瓊脂糖凝膠電泳或紫外分光光度計檢測瓊脂糖凝膠電泳法(常用）

DNA樣品在紫外線照射下發出的紅色熒光強度與DNA的含量成正比使用標準濃度的DNA樣品作對照，可以估計出被測DNA的濃度紫外分光光度計檢測

DNA在260nm處有一個明顯的吸收峰估計濃度在A2601OD相當于雙鏈DNA濃度50μg/mL

根據A260/A280比值估計DNA純度純DNA的A260/A280=1.8±0.1，RNA的比值為2.0左右。

>1.8可能有RNA未除去

<1.8可能有酚和蛋白質之類的雜質4.基本步驟11（7）DNA保存備用通常用pH8.0的TE（Tris-EDTA）緩沖液（推薦）或超純水于4℃或-20℃（推薦）冰箱保存、避免反復凍融，1-2年一般沒問題也可短時保存于100%無水乙醇中（幾天）

較長期保存可放置于-70℃超低溫冰箱，可保存5年以上4.基本步驟125.提取緩沖液對植物總DNA提取的影響與作用

現代分子生物學的發展導致DNA分離技術層出不窮,DNA已經可以從諸如化石、標本、木乃伊等極端材料中分離出來,也可以從痕量材料獲得DNA

無論什么材料,針對不同來源和特點,調整設計相應的提取緩沖液及不同的技術方案是十分重要和必需的在實際應用中可針對不同情況對具體實驗方案的各個部分進行不同組合。緩沖液的成分應根據分離對象的不同而變化，緩沖液的pH值、保護劑和表面活性劑都要根據不同樣品進行優化13

表面表面活性劑：十二烷基磺酸鈉(SDS)：是一種陽離子強表面活性劑,通常與蛋白酶K和抗氧化劑、螯合劑一起使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)：是一種在高鹽下能與核酸結合形成可溶、穩定的復合物,低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑酶抑制劑乙二胺四乙酸(EDTA)：可用于抑制金屬離子依賴性的酶(螯合Mg2+

、Ca2+)的活性牛血清白蛋白(BSA)

：可使一些降解酶的表面變性精胺及其他多胺:降低核酸酶的影響氰化物:降低重金屬氧化酶的影響5.提取緩沖液對植物總DNA提取的影響與作用14保護劑還原型巰基成分:

如β-巰基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等一些硫醇類物質，通常可用于保護DNA免受醌類物質、二硫化物、多酚氧化酶等物質的損害抗壞血酸、維生素C:

降低醌類物質的影響活性炭、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、重過亞硫酸鈉、硼砂等:

防止多酚類物質氧化聚乙烯吡咯烷酮(PVP):

減少酚類、醌類及丹寧類物質的影響5.提取緩沖液對植物總DNA提取的影響與作用15酚類雜質

對植物中次生產物酚類物質的去除，普遍是在提取液中加入適量的抗氧化劑和螯合劑,防止多酚氧化褐變在提取DNA過程中加入巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽及抗壞血酸等巰基試劑,抑制氧化反應，避免褐化在樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入高分子螯合劑PVP(聚乙烯吡咯烷酮)或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)等能絡合多酚和萜類物質離心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物質氧化成醌類,避免溶液變褐而具有抗氧化作用在提取液中加入適量的PVP或PVPP能提高DNA的純度，其用量視雜質的多少而定(1-6%)，PVP同時能有效去除多糖。因此將PVP和巰基乙醇配合使用并調整用量,能夠有效地防止多酚污染

6.DNA提取過程中雜質去除16多糖類雜質

植物組織中富含多糖,其許多理化性質與DNA很相似,因此很難將它們分開。常用方法是根據溶解性先沉淀多糖

（1）在氯仿處理后的上清液中，加2%CTAB

分離緩沖液（2）在DNA未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖如100mmol/LTris-HCl,pH8.0;5mmEDTA;0.35mol/LSorbitol(山梨醇)洗幾次（3）提高NaCl濃度至2.5mol/L或加NH4COOH

使終濃度為10mmol/L或0.5mLDNA液中加0.125mL4mol/LNaCl和0.625mL13%PEG8000（冰浴1h）或用水飽和乙醚，1.2-1.5mol/LNaCl

溶液將大部分多糖去除,再用2倍乙醇沉淀DNA可大大提高效率（4）高濃度KCH3COOH

有利于除去多糖

6.DNA提取過程中雜質去除17(5)DNA沉淀重懸于30%乙醇,4℃過夜先沉淀多糖,離心取上清加乙醇至80%重新沉淀DNA(6)常溫25oC異丙醇過夜沉淀DNA可減少雜質污染(7)在提取緩沖液中1/2體積的氯苯，氯苯與多糖的羥基作用而去除多糖

(8)如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對DNA具有特異性吸附的樹脂來純化DNA曾有文獻提到選用WizardPurificationKit，PRC-5柱，SephacrylS-1000或S-500，QiagenGenomictip500/G，或者CsCl梯度離心純化DNA(9)調節取樣時期可減少粗提產品中多糖含量，生長幼苗暗室暗化處理，黃化葉提取DNA可有效地防止多糖污染6.DNA提取過程中雜質去除18植物色素成分去除植物色素分布：在植物中廣泛存在種類：脂溶性和水溶性色素兩類脂溶性色素多為四萜類衍生物不溶于水，難溶于甲醇，易溶于乙醇、乙醚和氯仿等葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素、番紅花素和辣椒紅素等其中胡蘿卜素不溶于乙醇。水溶性色素：主要為花色甙類，又稱花青素，普遍存在于花中可溶于水與乙醇，不溶于乙醚與氯仿等有機溶劑，色澤隨pH改變

可以采用非可溶性PVP（polyvinylpyrrolidone）研磨樣品，PVP能絡合多酚類物質，不但能較徹底防止氧化作用，而且能有效的去除多糖和色素在DNA濃縮之前，再用CTAB處理1-2次；或采用乙醇等有機溶劑洗滌加入抗氧化劑，防止酚類物質褐化6.DNA提取過程中雜質去除19液氮：組織破碎、裂解細胞EDTA，Tris/HCl:緩沖體系使溶液pH不會變化太大，DNA在這一體系中呈穩定態，EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase的活性，防止DNA被DNase降解異丙醇/酒精：沉淀DNA；DNA溶于水，不溶于酒精，在用乙醇沉淀DNA時常加入單價的陽離子NaCl或NaCH3COOH，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀

RNase:

消化RNA。PVP（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮):抗氧化作用，絡合酚類物質和萜類物質,防止酚類物質氧化而發生褐變,也可有效的去除多糖和色素，色素是PCR反應中的強抑制劑，一定要除掉7.DNA提取過程中各試劑的主要作用20β巰基乙醇和抗壞血酸鈉：抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚類物質容易從基因組DNA去除蛋白酶K:是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質的一般降解。將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子分離出來NaCl:提供一個高鹽環境,使DNA充分溶解于液相中異戊醇：（1）在抽提DNA時，為了混合均勻，必須振蕩混勻數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，減少泡沫產生。一般采用氯仿：異戊酵=24：1或酚：氯仿：異戊醇=25:24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成）（2）同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定7.DNA提取過程中各試劑的主要作用21苯酚/氯仿：（1）苯酚/氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層（2）酚是強烈的蛋白質變性劑，用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相同時抑制了DNase的降解作用，能有效使蛋白質變性而除去，酚形成的有機相也可破壞蛋白質的膠體穩定性，從而蛋白質不會分布在水相中，避免了對核酸的污染7.DNA提取過程中各試劑的主要作用227.DNA提取過程中各試劑的主要作用（3）氯仿有強烈的脂溶性，去除脂類雜質，也有使蛋白質變性的作用（4）作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊酚的變性作用大，但與水相有一定程度的互溶，大約10-15％的水溶解在酚相中，損失了這部分水相中的DNA

氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA

（5）在抽提過程中混合使用酚與氯仿效果最好經酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用

238.常用植物總DNA提取方法及主要原理傳統的DNA提取與純化方法

CTAB和SDS法：在裂解細胞的基礎上，多次苯酚氯仿等有機溶劑抽提使蛋白質變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相,達到分離核酸的目的，加入RNA酶除去核酸中的RNA，加入異丙醇、乙醇等沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀，除去分離過程中殘留的有機溶劑和鹽離子，以免影響核酸溶解和抑制后續步驟的酶促反應，最后用TE溶解DNA備用DNA提取的新方法螯合樹脂、特異性DNA吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基礎上形成的DNA提取新方法248.常用植物總DNA提取方法及主要原理CTAB法及主要原理CTAB----Hexadecyltrimethylammoniumbromide;Cetrimoniumbromide;CTABr;Palmityltrimethylammoniumbromide/十六烷基三甲基溴化銨分子式C19H42NBr

分子量364.10；白色或淺黃色結晶或粉末，低溫時易沉淀

一種陽離子去污劑，在低離子強度時(0.1-0.5mol/LNaCl)，沉淀核酸與酸性多聚糖,而蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強度時(>0.7mol/LNaCl)，可與蛋白質和酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，不能沉淀核酸

因此，CTAB可從大量產生黏多糖的植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括大腸桿菌的某些株）制備純化的DNA，這種去污劑加入調節至高離子強度的細菌和細胞裂解液中(>0.7mol/LNaCl)，經過連續的酚/氯仿有機溶劑抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白質復合體，異丙醇/無水乙醇沉淀上清即可將DNA分離出來

CTAB還有提高DNA互補鏈復性速率及穩定已形成的DNA雙螺旋的作用

CTAB法的主要特點是應用范圍較廣25CTAB法

組分

用量終濃度CTAB

20g2%(W/V)1mol/LTris-HCl,pH8.0100mL0.1mol/L0.5mol/LEDTA,pH8.0200ml0.1mol/LNaCl

81.8g1.4mol/Lβ-巰基乙醇(用前加）

0.2%(V/V)2×CTAB緩沖液（1000mL)8.常用植物總DNA提取方法及主要原理26（1）2g幼嫩植物組織加液氮并迅速研磨成細粉，置入50mL離心管中繳入預熱治65℃的10mL的2×CTAB緩沖液，輕搖混勻（2）65℃水浴2h，輕搖混勻（3）冷卻至室溫，加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1），輕輕上下顛倒混勻直至上清液呈牛奶狀（4）4000×rpm離心10min（5）取上清液，加入等體積冰冷的異丙醇沉淀，挑出DNA（6）用70%和100%乙醇各洗一次（7）將DNA溶于適量的TE（pH8.0)中，加入RNA酶（終濃度100g/L）（8）電泳檢測或用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和質量CTAB法提取植物DNA步驟8.常用植物總DNA提取方法及主要原理278.常用植物總DNA提取方法及主要原理SDS法及主要原理SDS-Sodiumlaurylsulfate/十二烷基硫酸鈉結構式：CH3(CH2)11OSO3Na；分子量：288.39，白色至微黃色粉末，微有特殊氣味

一種陰離子去垢劑,在高溫(55-65℃)時裂解細胞，使染色體離析、蛋白變性，形成SDS/蛋白質/多糖復合物，釋放出核酸，提高鹽(KCH3COOH或NH4CH3COOH)濃度并降低溫度(冰浴)，使SDS-蛋白質復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式,使蛋白質及多糖雜質沉淀更加完全，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNASDS法操作簡單，溫和，可提取到高分子量的DNA,但產物含糖類雜質較多28SDS法組分

用量終濃度SDS

20g2%(W/V)1mol/LTris-HCl,pH8.5100mL0.1mol/L0.5mol/LEDTA,pH8.0100ml0.05mol/LNaCl

5.84g0.1mol/L蛋白酶K

0.05mg/mlSDS緩沖液（1000mL)Sharpetal.(1992)TheorApplGenet.8.常用植物總DNA提取方法及主要原理29SDS法提取植物DNA步驟（1）3-5g幼嫩植物組織加液氮并迅速研磨成細粉，置入50mL離心管中繳入預熱治65℃的20mL的SDS緩沖液及100μl蛋白酶K(終濃度0.05mg/ml)，輕搖混勻（2）65℃水浴2h，輕搖混勻（3）冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿，輕輕上下顛倒混勻（4）3000×rpm離心20min（5）取上清液轉入到另一離心管中，加入等體積氯仿，混勻后3000×rpm離心20min（6）取上清液轉入到另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕搖混勻，靜置一段時間后，挑出DNA,用70%和100%乙醇各洗一次,氣干（7）將DNA溶于適量的TE（pH8.0)中，加入RNA酶（終濃度100g/L），37℃保溫1-3h（8）加入等體積酚/氯仿，輕搖混勻，3000×rpm離心15min，取上清（9）加入等體積氯仿，輕搖混勻，3000×rpm離心15min，取上清（10）加入1/10體積的3MNaCH3COONa(pH5.2)，混勻后加入2倍體積的95%乙醇，挑出DNA,用70%和100%乙醇各洗一次,氣干（11）加入適量TE（pH8.0)溶解DNA（12）電泳檢測或用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和質量8.常用植物總DNA提取方法及主要原理308.常用植物總DNA提取方法及主要原理離液鹽作用變性蛋白和核酸改變水的結構、幫助核酸結合到硅膠膜上溶解多聚糖膠磁珠分離法硅膜吸附法31磁珠法主要原理通過細胞裂解液裂解細胞，游離出的核酸分子被特異吸附到含硅膠膜的磁性顆粒表面，而蛋白質等雜質不被吸附而留在溶液中

在磁場作用下使磁性顆粒與液體分開，回收磁珠-DNA混合物，再用洗脫液洗脫即可以得到純凈的DNA8.常用植物總DNA提取方法及主要原理32硅膜吸附法主要原理在離液鹽的作用下，水的結構發生改變，幫助核酸結合到硅膠膜上，而在無離液鹽的作用下，則將核酸進行洗脫8.常用植物總DNA提取方法及主要原理339.RNA提取RNA實驗的關鍵是分離得到全長的RNA實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染RNA酶廣泛存在而穩定、一般反應不需要輔助因子。可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等2.RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果,少量RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解難點：一、嚴格控制外源性RNA酶的污染

外源性的RNA酶：操作人員的手汗、唾液等，灰塵等。外源性RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽等

二、最大限度地抑制內源性的RNA酶

各種組織和細胞中含有大量內源性的RNA酶RNA提取的難點341.杜絕外源酶的污染

嚴格戴好口罩，手套

實驗涉及離心管、Tip頭、移液器、電泳槽、實驗臺面等要徹底處理

試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free

2.阻止內源酶的活性

選擇合適的勻漿方法和裂解液

控制好樣品的起始量

3.明確自己的抽提目的

任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。

RNA抽提成功的唯一經濟的標準是后續實驗的一次成功，而不是得率防止RNA酶污染的措施9.RNA提取35防止RNA酶污染的措施

1.

設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用2.所有玻璃器皿在使用前于180℃高溫烘烤6hr或更長時間3.

塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）4.

有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2

室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干5.

配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經

0.22μm濾膜過濾除菌6.

操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換9.RNA提取36焦磷酸二乙酯（DEPC）一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性異硫氰酸胍目前認為是最有效的RNA酶抑制劑，在裂解組織的同時也使RNA酶失活,既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用

氧釩核糖核苷復合物由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活其它SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用常用的RNA酶抑制劑。

9.RNA提取371.樣本前處理

選擇新鮮、幼嫩、生長旺盛的組織處于生長旺盛的時期收集細胞、新鮮血液，不得超過4小時液氮或加入RNase抑制劑保存,避免反復凍融，推薦使用專門的RNA樣品儲存液儲存2.細胞裂解

異硫氰酸胍/酚－TRNzol總RNA提取試劑胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒獨特配方—RNAplant植物RNA提取試劑3.RNA的純化及獲得

純化后不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用物質排除有機溶劑和金屬離子的污染蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度排除DNA分子的污染10.RNA提取流程38幾種RNA提取方法1.TRIzol法

TRIzol的主要成分:異硫氰酸胍和酚

異硫氰酸胍：解偶劑，一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質，主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放

酚：有效的變性蛋白質，但是它不能完全抑制RNA酶活性

TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase。

原理：TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水相層和有機層。RNA存在于水相層中。收集上面的的水相層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原9.RNA提取391．樣品處理：

稱取50-100mg幼嫩葉片（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTrizol充分勻漿，室溫靜置５min2．加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min3．4℃離心，12000g×15min，取上清4．加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min5．4℃離心，12000g×10min，棄上清6．加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清7.

晾干，加入適量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）測O.D值定量RNA濃度提取RNAA260/A280

值在1.6-1.8之間；產率植物葉片100-200μgRNA/gTRIzol法提取流程9.RNA提取40植物組織基因組DNA水相有機相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol-A+)

研磨9.RNA提取實驗流程圖412苯酚法

細胞內大部分RNA均與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RN