第5章植物細胞培養與次級代謝產物制備植物細胞培養是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織置于液體培養基中進行振蕩培養，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養增殖，獲得大量細胞的一種技術。5.1植物細胞培養及特點2/4/20231細胞培養與組織培養的區別1979年國際組織培養協會專業術語委員會建議：組織培養：從機體內取出組織或細胞，模擬機體內生理條件，在體外進行培養，使之生存或生長成組織。細胞培養：動植物細胞在體外條件下的存活或生長，此時細胞不再形成組織。2/4/20232植物細胞培養的特點與微生物相比細胞大（30-100倍）成團不耐剪切生長慢，周期長易污染（培養基適于微生物生長）光照影響較大，氧氣、二氧化碳含量影響較大。2/4/202335.2植物細胞培養技術5.2.1培養基5.2.2植物單細胞分離與小規模培養2/4/202345.2.2.1單細胞分離方法（一）機械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團優點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。2/4/20235（二）酶解法酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細胞的產量。(纖維素酶，果膠酶)優點可獲得較多的葉肉游離細胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。5.2.2.1單細胞分離方法2/4/20236細胞懸浮過濾與培養基混合植板培養克隆愈傷組織（三）愈傷組織誘導法振蕩、或加酶解。5.2.2.1單細胞分離方法2/4/202375.2.2.1植物單細胞小規模培養培養方法（一）看護培養（二）飼養層培養（三）液體淺層靜止培養（四）細胞同步化培養（五）細胞平板培養（六）微室培養2/4/20238（一）看護培養（nurseculture）Muir(1953)首創此法獲得煙草單細胞體系。優點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程2/4/20239（二）飼養層培養Horsch等（1980）建立培養皿培養基飼養細胞層培養細胞看護濾紙轉移濾紙2/4/202310（三）液體淺層靜止培養細胞培養皿三角瓶靜止2/4/202311（四）細胞的同步化培養細胞同步化：同一懸浮培養體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養中容易團聚并進入不同程度的分化狀態，因此，要達到完全同步化是十分困難的。同一培養體系的植物細胞經常不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞分裂、代謝以及生理生化狀態等復雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。什么措施？2/4/202312細胞周期2/4/202313（1）體積選擇法依據：細胞體積大小方法常規分選方法是梯度離心精細的分選可采用流式細胞儀優點操作簡單分選細胞維持了自然生長狀態，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細度較差2/4/202314（2）低溫處理可以提高培養體系中細胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細胞也獲得較明顯同步化效果。可能的原因不同的溫度對細胞的有絲分裂有極明顯的影響，在一定范圍內，溫度下降使細胞分裂速度減慢，細胞周期延長，從而相應地延長了分裂期的時間，使分裂指數提高，細胞同步化率升高。2/4/202315（3）饑餓法饑餓導致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細胞。將饑餓細胞轉入完整培養基中繼代培養時，細胞分裂又可重新恢復。2/4/202316（4）抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細胞培養中已有成功應用。利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。2/4/202317（五）細胞平板培養(platingculture)指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養基中進行培養的技術。Bergman(1960)首創單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經培養基洗滌2次以后，調整密度為5×103個/毫升植板：將1份已調整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養皿中，其厚度為5mm左右。2/4/202318細胞平板培養（platingculture)平板培養的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。每個平板形成的細胞團數植板率＝每個平板接種的細胞總數2/4/202319細胞平板培養(platingculture)優點：單細胞在培養基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優點，被廣泛應用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質易積累造成毒害或影響組織吸收。2/4/202320（六）微室培養

(microchamberculture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養在少量培養基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。由Jones等在1960年設計的。優點：可對培養細胞連續進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養基少，營養和水分難以保持，pH變動幅度大，培養細胞僅能短期分裂。細胞起始密度：30～80個/室。2/4/2023212/4/2023225.2.3細胞系與細胞株細胞系（cellline）：是以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。細胞株（cellstrain）：指從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或提高篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。2/4/2023235.2.3.1細胞株篩選（一）一般步驟（1）愈傷組織的誘導。適宜外植體、培養基、激素（2）單細胞分離。固體培養基生長較快（3）細胞無性系的分離。液體培養基生長較快（4）細胞株篩選。選擇目標產物含量高的（5）性能評價。可以中試（6）細胞株獲得。2/4/202324（二）定向富集馴化（1）激素自養型細胞株的篩選馴化（2）耐高劑量有毒物質的細胞株馴化（乙酸鹽苯甲酸鹽）梅興國（2001）通過在培養基中添加1.6mM的L-Phe，篩選出了抗Phe的紅豆杉細胞懸浮系，其紫杉醇含量高于原型細胞3～5倍。（3）直選法

李志勇等（2002）直接從起始細胞中挑選不同細胞團建立了10個大蒜細胞懸浮系，比較研究顯示，不同懸浮細胞系的SOD合成能力最大差異可達5倍。2/4/202325（三）人工誘變篩選細胞系統：（1）懸浮培養系統（2）愈傷組織系統（3）原生質體系統誘變方法（1）物理方法射線（2）化學方法亞硝基胍2/4/2023265.2.3.2細胞株保存（一）繼代培養保存法時間？（二）低溫保存法5-10℃10天（三）冷凍保存 （1）低溫保存-20℃

（2）超低溫保存液氮2/4/2023275.2.4植物細胞大規模懸浮培養◆根據培養規模：小規模和大規模（批量）培養◆根據培養方式：懸浮、平板、看護培養、固定化 懸浮培養分為：分批培養流加式培養半連續培養連續培養（恒化培養）◆根據要求產物：用于誘變和生產次生(級)產物(Secondaryproducts)的細胞培養2/4/2023285.2.4植物細胞大規模懸浮培養懸浮培養定義與優點細胞懸浮培養的應用用于建立懸浮培養的細胞應具備的特點懸浮系的建立過程成功的懸浮細胞培養體系特征懸浮細胞的生長動態衡量懸浮細胞生長狀況的方法影響懸浮細胞生長的因素2/4/202329一、懸浮培養的定義與優點（1）定義：懸浮培養(Suspensionculture)是細胞培養的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養基中進行培養增殖的技術。（2）優點

①

培養細胞可不斷增殖，且生長速度快。

②

液體狀態下便于細胞和營養物質的充分接觸和交換，細胞狀態可以相對保持一致。③可以借鑒發酵工程的成熟技術，容易放大實現產業化。2/4/202330二、細胞懸浮培養的應用Suspensioncells懸浮細胞Plants植株Artificialseeds人工種子Protoplasts原生質體Mutation突變體Secondaryproducts次級代謝產物2/4/202331①松散性好，疏松易碎。②其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。③呈細小顆粒狀。④增殖快、再生能力強。適宜懸浮培養適宜再生植株三、用于建立懸浮培養的細胞應具備的特點：2/4/202332四、懸浮系的建立過程愈傷callus150~250ml搖瓶flask離心分離centrifugeisolation繼代培養subculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm2/4/2023332/4/202334五、成功的懸浮細胞培養體系具備的特征①懸浮培養分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下。②均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。③細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般7～10天便可增加一倍。④培養基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。2/4/2023352/4/202336六、懸浮細胞的生長動態2/4/202337七、衡量懸浮細胞生長狀況的方法根據不同培養時間的細胞數變化，或細胞質量變化。鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應細胞生長情況干重：鮮細胞烘干至衡重，反應細胞質量生長速率(p)：不同時間細胞密度(x)的自然對數與起始密度(x0)的自然對數之差與培養時間(t)的比值

p＝(lnx-lnx0)/t2/4/202338八、影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質量接種細胞密度：懸浮細胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個細胞/毫升。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細胞分裂、增殖的最低接種量。培養條件：培養基、方式、溫度、繼代周期。2/4/202339八、影響懸浮細胞生長的因素4.培養基應用條件培養基（生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養基）提供單細胞生長和分裂所需的特殊代謝物。基本培養基成分的調節視不同的培養目的而定培養基設計時，一般均以誘導愈傷組織形成的培養基為基礎進行調整。常用的培養基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應用。2/4/202340八、影響懸浮細胞生長的因素5.培養方式：搖瓶，反應器（氣動式、攪拌式）；分批培養，半連續培養和連續培養6.溫度25℃7.繼代周期指具有一定起始密度的細胞，從開始培養到細胞數目和總重量增長停止的一個過程。培養周期的長短是由起始細胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養（Subculture）：繼初代培養之后的連續數代的擴繁殖培養過程。2/4/202341植物細胞懸浮培養的生物反應器一、定義：生物反應器是指用于高等生物細胞批量化培養的裝置及其相應控制系統。二、用于懸浮培養的反應器種類：

1.機械式

2.氣動式包括氣升式和鼓泡式三、氣動式反應器的優缺點

1.優點剪切力小，對細胞傷害小，結構簡單，功耗低，

2.缺點難適于細胞高密度培養2/4/202342四、適合植物細胞培養的反應器應該具備的特征有適宜的氧傳遞特點。能保證良好的液體流動性。較低的剪切力。方便調節光照。2/4/202343五、機械攪拌式反應器

（stirredtankbioreactor)（1）組成（2）優點攪拌均勻供氧和混合效果好（3）缺點

剪切力大2/4/2023442/4/202345六、氣升式反應器

(air-liftbioreactor)Flash（1）組成：2/4/202346七、鼓泡式反應器

（Bubblingreactor）2/4/202347反應器類型體積（L）培養植物種類攪拌式7，15D.carota

胡蘿卜攪拌式20，15500N.tabacum

煙草攪拌式5000C.roseus

長春花螺旋攪拌式20C.blumei

五彩蘇提升攪拌式2.5P.elliotii

濕地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人參鼓泡式65，1500N.tabacum

煙草外環氣升式10，30，85C.roseus

長春花導筒氣升式20，210D.lanata

狹葉毛地黃轉鼓式1－4V.rosea

長春花植物細胞培養生物反應器2/4/2023485.2.5植物細胞固定化培養定義：細胞固定化（cellimmobilization）是指將游離的細胞包埋在支持物內部或表面，培養液呈流動狀態進行培養的一種培養方式。優勢：（1）細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產物的積累。（2）利于保持培養液流體性質（3）剪切力小（4）利于進行連續培養和生物轉化2/4/2023495.2.5植物細胞固定化培養固定形式：包埋式固定化培養系統：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等附著式固定化培養系統：支持物多采用尼龍網、聚氨酯泡沫和中空纖維等。Alfermann等(1983)用氣升式系統，采用海藻鈣固定細胞成功地用30L和200L的反應器生產地高辛。Jose等(1983)進一步用中空纖維反應器培養胡蘿卜和碧東茄生產代謝產物酚類物質Flash2/4/2023505.2.6植物細胞兩相培養（一）兩相培養(two—phaseculture)概念指在植物細胞培養基中加入有機溶劑或者有吸附作用的多聚化合物，形成的培養體系。培養體系由于分配系數不同而形成上、下兩相，細胞在水相中生長并合成次生代謝物，這些次生代謝物又通過主動或被動運輸的方式釋放到胞外，并被另一相所吸附。能夠減少產物反饋抑制作用，提高產物產量。2/4/2023515.2.6植物細胞兩相培養（二）建立植物細胞兩相培養體系應注意的事項：添加物對細胞無毒，不影響細胞生長與目的產物的合成。產物易溶于有機相或被多聚化合物吸附。兩相容易分離添加相不吸收培養基的有效成分。2/4/2023525.2.6植物細胞兩相培養（三）兩相類型：液-液系統和液-固系統液-液系統：分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物。分離相和培養基的化學性質和比重不同。液-固系統：是指提取相以固態形式存在于系統中，主要通過吸附分離目的產物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹脂。2/4/202353

5.2.6植物細胞兩相培養（四）紅豆杉細胞兩相培養生產紫杉醇實驗材料：東北紅豆杉細胞系培養基：第一相：B5培養基，第二相：5％(v/v)的松油醇，產物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。接種量:10g(鮮重)/100ml培養基/250mL三角燒瓶。培養條件：25℃，120rpm，黑暗培養。2/4/202354■細胞干重；▲紫杉醇產量；兩相系統——；單相系統－－ 第二相的加入，使得紫杉醇產量提高到30.19mg/L，比對照增加103%；63％的紫杉醇從胞內的釋放出來，其中有75％轉移至有機相。2/4/2023555.3植物細胞培養生產次級代謝產物應用培養細胞系統合成有用的天然產物在醫藥、食品、輕化工業等領域具有重要意義。目前有約25％的法定藥品來自植物，其有效成分均為次級代謝產物。許多植物次級代謝產物是優良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌，而對環境和人畜無害，是理想的環保產品2/4/202356部分代表性植物次級代謝產物及其植物資源工業用途次生產物植物資源藥用代謝產物可待因罌粟薯蕷皂苷配基三角葉薯蕷奎寧金雞納樹地高辛狹葉毛地黃莨菪胺曼陀羅長春花堿長春花殺蟲劑除蟲菊酯除蟲菊食品，飲料留蘭香薄荷化妝品茉莉油茉莉花2/4/2023575.3.1植物次級代謝產物的主要類型1.酚類化合物－黃酮類、醌類和簡單酚類黃酮類： 結構：C6-C3-C6

生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。 功效：為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。醌類化合物： 結構：由苯式多環芳烴衍生的芳香二氧化合物， 種類：苯醌、萘醌。 功效：呈現顏色，具有抗菌、抗癌作用。2/4/2023582.萜類化合物組成單元：異戊二烯合成途徑：異戊二烯途徑種類：單萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾類化合物。萜類化合物已超過2萬種。單萜和倍半萜是植物揮發油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價值。倍半萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜皂甙：人參皂甙。甾體皂甙：薯蕷皂甙。2/4/2023593.含氮化合物包括：生物堿、胺類、非蛋白質氨基酸和生氰苷種類：5500種以上分布：雙子葉植物生物堿的作用：藥用，植物抗毒素。目前對生物合成途徑研究比較清楚的有：煙草的煙堿(nicotine)、毒藜堿(anabasine)和吡咯生物堿

(pyrrolizidinealkaloid)，毛茛科植物的小檗堿(berberine)，曼陀羅屬植物的莨菪堿(tropine)和東莨菪堿(scopolamine)。煙堿2/4/2023605.3.2植物次級代謝產物的生物合成途徑（一）聚酮途徑又稱乙酸丙二酸途徑，乙酰輔酶A通過直線式聚合生成脂肪酸和環狀次級代謝產物。植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類及類黃酮化合物等（二）莽草酸途徑PEP與4-磷酸赤蘚糖縮合，經過莽草酸生成芳香族氨基酸，進一步生成生物堿、類黃酮、香豆素等。（三）甲瓦龍酸途徑又稱甲戊二羥酸（甲羥戊酸）途徑，是乙酰輔酶A經過甲戊二羥酸生成異戊二烯，再合成萜類、甾體、蒽醌等。2/4/2023615.3.3培養條件下植物細胞次生產物積累的特性生長偶聯型產物合成與細胞生長成正比如長春花中長春花堿的合成、煙草細胞煙堿合成、薯蕷中薯蕷皂甙的合成。中間型產物僅在細胞生長下降時合成，細胞處于指數生長期或停止生長產物都不合成蒽醌類物質合成的植物細胞、莨菪烷類合成的植物細胞等屬于此類型。非生長偶聯型產物合成在細胞生長停止以后。如紫草寧。2/4/2023625.3.4提高細胞次生產物產量的途徑1.選擇適宜的起始材料－－種類、部位（基因型）梔子（Gardeniajasminoides）胚軸銀杏 子葉當歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄2.培養基既要滿足植物細胞的生物量增長，還要滿足細胞合成及積累次生產物的需要。2/4/2023635.3.4提高細胞次生產物產量的途徑3.前體（precursor）的應用作用：提高目的產物產量。紫草-L-Phe-紫草素選擇對某一目的產物來講可能有多種前體物質同一種前體物質又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產物。針對其合成的關鍵生化過程進行前體物質添加。注意前體物質的使用時間。紫蘇-色胺-week2注意前體濃度。過量也可能產生反饋抑制。2/4/202364人參皂甙的生物合成途徑乙酰輔酶A

甲羥戊酸（MVA）反式角鯊烯（C30）

2,3-氧化鯊烯環阿屯醇達瑪烯二醇香樹素植物甾醇人參皂甙Rg1人參皂甙Ro2/4/2023655.3.4提高細胞次生產物產量的途徑4.激發子（elicitor）的應用也稱誘導子，是指能夠誘導植物細胞中某些反應，并形成細胞特征性自身反應的分子。非生物激發子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發子外源激發子：菌絲、微生物機體提取物及微生物產生的多糖、蛋白和脂肪酸等內源性激發子：來源于植物結構的化合物。如降解細胞壁的酶、細胞壁碎片、寡聚糖等有機分子。2/4/2023665.3.4提高細胞次生產物產量的途徑激發子促進次生產物積累與其種類和濃度有關