生物分離工程初級分離技術總體學習目的和要求了解蛋白質表面特性，掌握各種沉淀和泡沫分離的原理、特點以及應用范圍。目錄引言沉淀分離蛋白質表面特性鹽析沉淀等電點沉淀有機溶劑沉淀熱沉淀其他沉淀法沉淀生成動力學泡沫分離引言－學習要點識記：初級分離概念理解：初級分離特點

初級分離概念初級分離是指從菌體發酵液、細胞培養液、胞內抽提液（細胞破碎液）及其他各種生物原料初步提取目標產物，使目標產物得到濃縮和初步分離的下游加工過程。

初級分離特點分離對象：體積大、雜質含量高；分離技術：低操作成本、適于大規模生產；分離方法：重力沉降、離心沉降、膜分離、萃取、吸附、沉淀分離及泡沫分離等沉淀分離－學習要點識記：鹽析和鹽溶概念理解：蛋白質凝集沉淀的屏障，各種沉淀方法的原理和影響因素應用：采用不同的試劑方法實現蛋白質的沉淀

沉淀的定義由于物理環境的變化而引起溶質溶解度的降低、生成固體凝聚物的現象，稱為沉淀。

沉淀與結晶的區別沉淀生成的固體顆粒是不定形的結晶產品為單一組分，而沉淀凝聚物則成分非常復雜（除了目標產物外，還夾雜著多種共存的雜質、鹽和溶劑等）沉淀的純度遠低于結晶多步沉淀操作也可獲得高純度的目標產品沉淀技術適用范圍

沉淀分離在生物分離過程中應用相當廣泛。一般情況下，沉淀分離方法在生物下游加工過程中通常作為初級分離技術加以使用，但在實際過程中也有僅通過沉淀分離得到目標產品的工業實例。是傳統的分離技術之一，目前廣泛用于實驗室和工業規模蛋白質的回收、濃縮和純化。蛋白質表面特性－蛋白質組成蛋白質組成20種氨基酸構成的兩性高分子電解質，包括疏水性氨基酸和親水性氨基酸蛋白質折疊趨勢疏水性氨基酸：向內部折疊的趨勢親水性氨基酸：分布于蛋白質外表面的趨勢

結果

在蛋白質三維結構中仍會有部分疏水性氨基酸殘基暴露于表面，在蛋白質表面形成一定的疏水區

膠體的定義膠體是一種尺寸在1～100nm以至1000nm的分散體。它既非大塊固體，又不是分子分散的液體，而是具有兩相的微不均勻分散體系。

-《被遺忘了尺寸的世界》WilhelmFriedrichOstwald(1853–1932)膠體的性質比表面增大，界面現象重要

強烈的尺寸效應丁達爾現象布朗運動電泳現象蛋白質表面特性－蛋白質性質蛋白質的膠體性質

蛋白質的分子量約6～1000kDa，分子直徑約為1~30nm。在此粒徑范圍內，蛋白質可視為膠體，并表現出膠體溶液的部分性質蛋白質的兩性電離和等電點

蛋白質兩端及側鏈中有一些解離基，解離程度受pH影響。蛋白質的變性

物理因素：加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波的作用等；化學因素：有強酸、強堿、尿素、重金屬鹽、SDS等。

蛋白質表面特性－沉淀屏障蛋白質分子周圍的水化層水溶液中蛋白質可視為膠粒，其周圍存在著穩定的水化層，膠粒外的這部分水客觀上起排斥作用，稱為“水化層斥力”分子間的靜電排斥作用根據擴散雙電層理論，膠粒是帶電的，其表面吸附相反電荷的反離子，這些位于膠粒周圍過量的反離子好像膠粒四周為離子氛所包圍。當兩個膠粒（蛋白質）趨近而使離子氛發生重疊時，處于重疊區內的反離子濃度較大，從而破壞了原有電荷的對稱性，引起離子氛中電荷重新分布，即離子從濃度較大的重疊區向未重疊區擴散。這種擴散的結果就是膠粒受到斥力而相互脫離。分子間的靜電排斥作用發酵液是一種膠體溶液，膠體粒子（發酵液中菌體或細胞）表面一般帶有負電荷，由于靜電引力的作用，使它周圍吸附一些帶相反電荷的粒子（即正電荷），于是形成雙電層。雙電層的負電層在質粒上不動，而正電荷受溶液熱運動的影響，具有離開膠粒表面的趨勢，于是雙電層就分裂成兩部分：吸附層（緊密層）和擴散層，它們之間的界面稱為Stern界面。在擴散層邊緣有一滑動面，在面內的液體會隨臨近膠體的相對運動而一起移動，面外液體不隨膠體運動。在不同界面會形成不同的電位。膠體表面電位為φs，Stern平面上電位為φd，滑動面上電位為ξ（能實際測得，所以它是表征雙電層特性的重要參數）。ξ電位越大，膠粒間電排斥作用就越強，膠粒的分散程度也越大。

ξ電位與擴散層厚度和電動電荷密度（滑動面上電荷密度）成正比，而擴散層厚度又與溶液性質（電解質的種類，濃度，pH值等）有關，例如，對帶負電性菌體的發酵液，高價陽離子的存在，可壓縮擴散層的厚度，促使ξ電位迅速降低，而且化合價越高，這種影響越大。當雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華力時，由于熱運動的結果導致膠粒的互相碰撞而聚集起來。所以，要實現蛋白質沉淀，可以采用降低蛋白質周圍水化層和雙電層厚度的方法來降低蛋白質溶液的穩定性。而水化層厚度及ζ電位與溶液性質（電解質種類，濃度計pH值等）密切相關，所以，蛋白質的沉淀可采用恒溫條件下添加各種不同試劑的方法實現。蛋白質表面特性

－沉淀策略及方法策略破壞蛋白質四周水化層降低雙電層厚度

沉淀方法

改變溶液pH值

加入無機鹽或改變無機鹽種類加入水溶性有機溶劑添加脫水劑蛋白質表面特性

－常用的沉淀技術鹽析沉淀等電點沉淀有機溶劑沉淀聚合物沉淀熱沉淀鹽析沉淀-學習要點識記：鹽析和鹽溶概念

理解：鹽析沉淀的原理，影響鹽析的各種因素

應用：掌握鹽析操作過程

鹽析沉淀-鹽析的定義定義

蛋白質在高離子強度的溶液中溶解度降低、發生沉淀的現象稱為鹽析（Salting-out）溶解度與I的關系－Cohn方程

鹽析沉淀-鹽析原理低離子強度下的鹽溶

向蛋白質的純水溶液中加入電解質后，蛋白質將吸附鹽離子，而形成擴散雙電層（產生分子間相互排斥作用）導致蛋白質的溶解度增大，發生鹽溶高離子強度下的鹽析溶液主體中那些與擴散層的離子電荷符號相同的電解質離子將把反離子壓入（排斥）到雙電層中，由于鹽的水化作用，其將爭奪蛋白質水化層中的水分子，使蛋白質表面疏水區脫水而暴露，增大它們之間的疏水性作用，容易發生凝聚，進而沉淀。鹽析沉淀-鹽析原理圖示鹽析沉淀-影響鹽析因素蛋白質的分子量和結構

無機鹽種類和濃度

相同離子強度下，不同種類的鹽對蛋白質的鹽析效果不同，即鹽的種類將影響到Cohn方程中的鹽析常數鹽的種類對蛋白質溶解度的影響與離子的感膠離子序列相符鹽析沉淀-無機鹽的選擇溶解度大，可配制成具有較高離子強度的無機鹽溶液。溶解度受溫度的影響較小。鹽溶液密度不高，以便蛋白質沉淀的沉降或離心分離。硫酸銨是常用的鹽析劑。溫度和pH值

在低離子強度溶液中，蛋白質的溶解度在一定的溫度范圍內隨著溫度升高而增大在高離子強度溶液中，溫度的升高利于蛋白質脫水，破壞水化層并導致蛋白質溶解度的降低

在pH值接近蛋白質的等電點的溶液中，蛋白質的溶解度最小。

因此，蛋白質的鹽析沉淀操作需選擇合適的pH值和溫度，使蛋白質的溶解度最小。同時保證鹽析操作條件要溫和，不能引起目標蛋白質的變性。鹽析操作-沉淀劑性質

對于用于沉淀劑的無機鹽試劑，了解其性質，特別是無機鹽的溶解性質（溶液密度、飽和濃度等），是必需的。以硫酸銨為例：20℃下，飽和濃度為4.05mol/L（相當于534g/L）

飽和密度為1.235kg/L；0℃下，飽和濃度為3.825mol/L（相當于505g/L）

鹽析操作-溶解度曲線確定離心分離沉淀物并重新溶解測定其中總蛋白和目標蛋白的濃度以飽和度為橫坐標，上清液中總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質溶解度曲線Typicalammoniumsulphateprecipitationrangesforproteinsfromacrudeextractinsupernatant.(●)EGFPrelativecontentinsupernatant,(■)totalproteinrelativecontentinsupernatant

NormalizedeGFPcontentintheprecipitatedpelletatdifferentsaturationofammoniumsulfate鹽析操作-無機鹽加入量硫酸銨的摩爾濃度由M1增大到M2所需要加入的硫酸銨質量W為

20℃0℃如果用飽和度S代替摩爾濃度M，等電點沉淀-學習要點理解：等電點沉淀法原理應用：了解等電點沉淀法的優缺點和適用范圍等電點沉淀-定義利用蛋白質在pH值等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀分級的方法稱為等電點沉淀法

等電點沉淀原理利用在低離子強度下蛋白質溶解度較低的特性，調整溶液pH值至等電點或在等電點的pH下利用透析等方法降低離子強度，使蛋白質沉淀。等電點沉淀-沉淀條件較低的溶液離子強度溶液的pH值接近等電點等電點沉淀-實現方式在低離子強度下調整溶液pH值至等電點在等電點的pH值下利用透析等方法降低溶液的離子強度，使蛋白質沉淀

等電點沉淀-操作特點等電點沉淀在較低的離子強度下進行，因此沉淀操作結束后無需脫鹽

與其它沉淀結合使用，例如在等電點附近進行的鹽析沉淀操作時可以獲得更小的蛋白質溶解度

溶液的pH值調節方便，但過低的蛋白質等電點容易引起目標蛋白質變性有機溶劑沉淀-學習要點理解：有機溶劑沉淀法原理應用：了解有機溶劑沉淀法的優缺點和適用范圍有機溶劑沉淀-原理向蛋白質溶液中加入水溶性有機溶劑：水的活度將降低有機溶劑對水具有很大的親和力，能夠爭奪蛋白質表面的水分子。結果：隨有機溶劑濃度增大，水化程度降低，溶液的介電常數下降，蛋白質分子間的靜電引力增大，從而發生凝聚和沉淀

有機溶劑沉淀-原理圖示有機溶劑沉淀-特點優點有機溶劑密度較低，易于沉淀分離

與鹽析沉淀相比，沉淀產物不需脫鹽

缺點有機溶劑沉淀容易引起蛋白質變性常用的有機溶劑沉析劑選擇依據：不會對蛋白產生變性；溶解度高；介電系數小；毒性小，容易回收乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數小，60%乙醇的介電常數是48 丙酮的介電常數是22容易獲取影響因素及控制A、[乙醇]：通常隨[乙醇]上升，protein溶解度下降。過多加入乙醇也可能導致樣品變性。B、[pro]：避免使用很稀的濃度，以免使用大量乙醇。一般認為，對于蛋白質溶液0.5%～2%起始濃度較合適,對于粘多糖以1%～2%為起始濃度為宜C、T：當乙醇與水混合時，會放出大量的稀釋熱，使溶液T顯著升高，對不耐熱的pro影響較大。解決辦法：攪拌、少量多次加入，以避免溫度驟然升高損失pro活力。另一方面溫度還會影響有機溶劑對pro的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。但太低溫度雜蛋白可能過多。D、pH值：在確定了[乙醇]以后，pro最低溶解度出現在蛋白的pI處，因此可以通過調節pH值來選擇性分離蛋白質。E、加入金屬離子（相當于結合了金屬離子沉淀，不過介電系數降低有利于金屬離子結合到蛋白成鹽而沉淀）有機溶劑沉淀法操作注意事項選擇性變性沉淀法利用蛋白質、酶、核酸等生物大分子對某種物理或化學因素的敏感性差異，實現分離。加入變性劑選擇性熱變性選擇性酸堿變性使用時需慎重，目標蛋白很穩定時方可用！蛋白變性后沉淀：蛋白分子變性后，蛋白分子內疏水鍵打開，與其它分子疏水鍵形成新的疏水鍵，從而形成分子量更大的復合大分子要區別凝絮和變性沉淀區別，凝絮過程中也有大分子復合物產生，主要是凝絮劑起架橋作用把蛋白集合在一起（如聚電解質沉淀法，聚陽離子殼聚糖作廢水澄清劑法，都是凝絮法）熱沉淀-學習要點理解：了解熱沉淀原理

熱沉淀-原理在較高的溫度下，熱穩定性差的蛋白質將發生變性，有規則的肽鏈結構被打開呈松散狀不規則的結構，分子的不對稱性增加，疏水基團暴露，進而發生凝聚和沉淀，利用這一現象，可根據蛋白質間的熱穩定性的差別進行蛋白質的熱沉淀，以分離出熱穩定性高的目標蛋白產物

該過程與熱力學沉淀方法不同，熱沉淀過程是基于蛋白質的變性動力學其他沉淀技術聚合物沉淀

非離子型聚合物沉淀聚電解質沉淀

重金屬鹽沉淀蛋白質

生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質機理：聚乙二醇(PEG)分子利用其龐大的體積和分支，從溶劑排斥蛋白質，導致蛋白結合；剝離蛋白水合膜；聚合物與被分離物質共沉；被分離物質在水相和聚合物間分配；被分離物與聚合物形成復合物。優點：1.室溫2.顆粒大，易于收集3.提高蛋白質的穩定性4.生物相容性好缺點：PEG溶液相難和蛋白樣品分離（DEAE-纖維素吸附蛋白，而PEG不吸附）；且粘度高；價格貴非離子型聚合物沉淀機理：架橋；剝離蛋白表面水膜；電中和效應常用材料：聚丙烯酸（pH2.890%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亞胺聚苯乙烯季胺鹽（pH10.4,95%蛋白沉淀）聚電解質沉淀原理：金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質分子中的特殊部位起反應造成的。例如鋅易與組胺酸殘基中咪唑基結合，使蛋白質的等電點轉移，從而降低蛋白質的溶解度。也有金屬離子能氧化巰基，形成蛋白分子通過巰基聚集而形成沉淀。有些過渡態金屬由于可接受成對電子，有多個配位部位可起到蛋白分子間（特別是變性分子間）搭橋，形成網絡狀鹽結構，而聚集蛋白形成沉淀。特點：有時候產生變性（在沉淀過程中）需要分離去金屬離子，特別是重金屬重金屬鹽（金屬離子）沉淀一般可分三類：①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環化合物強烈結合的一些金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Ｃo2+、Ni2+、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能與羧酸結合而不與含氮化合物結合的一些金屬離子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巰基化合物強烈結合的一些金屬離子，如：Ｈg2+、Ag2+、Pb2+。實際應用時，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。復合物中金屬離子的去除，可用離子交換法或EDTA金屬螯合劑。生物堿是植物中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質，凡能使生物堿沉淀，或能與生物堿作用產生顏色反應的物質，稱為生物堿試劑。如鞣酸、苦味酸和磷鎢酸等。當蛋白質溶液pH值低于其等電點時，蛋白質為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結合形成鹽而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有機酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最為靈敏而且特異，因此，廣泛的用于蛋白質的沉淀。生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質沉淀生成動力學-沉淀生長

異向生長

發生在沉淀生成初期，微細的蛋白質顆粒為布朗粒子，沉淀生長為擴散速率控制同向凝聚

較大的沉淀顆粒在攪拌剪切作用下通過碰撞而進一步凝聚，生成大顆粒沉淀溶解度是一個平衡特性，但是溶解度值的降低是一個動力學過程。當體系變得不穩定以后，分子互相碰撞并產生聚集作用。通常認為相互碰撞由下面幾種運動引起：①熱運動，Bromnian運動；（二級生長動力學）②對流運動，由機械攪拌產生；③差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。前兩種機理在蛋白質沉淀中起主導作用，第③種機理在沉降過程中起主導作用(如在廢水處理中)。

異向聚集：由Brownian運動（懸浮在液體或氣體中的微小粒子所做的不停頓的無規則運動）所造成的碰撞導致。

同向聚集：而由對流運動所造成的碰撞導致。1.4沉淀生成動力學①熱運動，Bromnian運動；布朗離子的擴散控制，發生異向聚集（二級生長動力學）②對流運動，由機械攪拌產生；對于大于1微米的離子，主要受液體剪切作用，顆粒間相互碰撞，發生同向聚集。（二級生長動力學）具體速度系數泡沫分離識記：泡沫分離的概念理解：泡沫分離的原理、優勢應用：泡沫分離的應用泡沫分離概念泡沫分離是根據表面吸附原理，利用通氣鼓泡在液相中形成的氣泡作為載體對液相中的溶質或顆粒進行分離的方法。又稱為泡沫吸附分離。該分離過程必須要在表面活性物質存在的條件下才能發生。例如：日常生活中的各種洗滌作用就是依據泡沫分離的原理。泡沫分離技術是近十幾年發展起來的新型分離技術之一。泡沫分離是根據吸附的原理，向含表面活性物質的液體中鼓泡，使液體內的表面活性物質聚集在氣液界面（氣泡的表面）上，在液體主體上方形成泡沫層，將泡沫層和液相主體分開，就可以達到濃縮表面活性物質（在泡沫層）和凈化液相主體的目的。被濃縮的物質可以是表面活性物質，也可以是能與表面活性物質相絡合的物質，但它們必須具備和某一類型的表面活性物質能夠絡合或鰲合的能力。人們通常把凡是利用氣體在溶液中鼓泡，以達到分離或濃縮目的的這類方法總稱為泡沫吸附分離技術，簡稱泡沫分離技術。泡沫分離原理泡沫分離(FoamSeparation)又稱泡沫吸附分離(FoamSeparationAdsorbent)技術，早在1915年就開始應用于礦物浮選20世紀50年代末首先是從溶液中回收金屬離子的課題開始，前期研究了泡沫分離金屬離子的可行性20世紀60年代中期采用泡沫分離法脫除洗滌劑工廠排放的一級污水和二級污水中的表面活性劑——直鏈烷基磺酸鹽和苯磺酸鹽獲得成功1977年泡沫分離DNA、蛋白質及液體卵磷脂等生物活性物質分離原理表面活性：物質顆粒在兩相界面上時，由于受力不均勻，因此需要額外能量維持運動穩定，這種能量就稱為表面自由能。加入表面活性劑（一般為兩親分子），可占據兩相界面，排擠物質顆粒，從而減少表面自由能，使體系穩定，屬于自發過程。不同表面活性劑在界面吸附能力不同，根據這點可直接用于生物表面活性物質，如蛋白，核酸的分離。泡沫分離過程是利用待分離物質本身具有表面活性(如表面活性劑)或能與表面活性劑通過化學的、物理的力結合在一起(如金屬離子、有機化合物、蛋白質和酶等)，在鼓泡塔中被吸附在氣泡表面，得以富集從底部通入大量氣泡溶質吸附在氣泡上并隨之上升泡沫層它的分離作用主要取決于組分在氣－液界面上吸附的選擇性和程度，其本質是各種物質在溶液中表面活性的差異Γ為吸附溶質的表面過剩量，即單位面積上吸附溶質的摩爾數與主體溶液濃度之差,對于稀溶液即為溶質的表面濃度，可通過σ(溶液的表面張力)與濃度c(溶質在主體溶液中的平衡濃度)來求得；Γ/c為吸附分配因子。溶液中表面活性劑濃度c和表面過剩量Γ的相互關系可用右圖表示。在b點之前，隨著溶液中表面活性劑濃度c增加，Γ成直線增加：Γ=Kc

b點后溶液飽和，多余的表面活性劑分子開始在溶液內部形成“膠束”，b點的濃度稱為臨界濃度(CMC)，此值一般為0.01～0.02mol/L左右，分離最好在低于CMC下進行。泡沫分離設備和操作泡沫的形成首先在液體內部形成被包裹的氣泡。在此瞬時，溶液中表面活性劑分子立即在氣泡表面排成單分子膜，親油基指向氣泡內部，親水基指向溶液該氣泡會借浮力上升沖擊溶液表面的單分子膜。在某種情況下，氣泡也可從表面跳出。此時，在該氣泡表面的水膜外層上，形成與上述單分子膜的分子排