第八章微生物遺傳第一節遺傳的物質基礎第二節質粒和轉座子第三節誘發突變——Ams實驗第四節微生物育種一.DNA作為遺傳物質1.Griffith的轉化試驗（1928年）2.3.二.RNA作為遺傳物質一.質粒

一種獨立于染色體外，能進行自主復制的細胞質遺傳因子，主要存在于各種微生物細胞中。質粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb（細菌質粒多在10kb以內）。1.質粒的分子結構通常以共價閉合環狀(covalentlyclosedcircle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞中，也發現有線型雙鏈DNA質粒和RNA質粒。2.質粒的分離堿提取法：①菌體的培養和收集：一般采用豐富培養基對菌體進行培養，當細胞生長到指數期后期時，離心收集細胞。②溶菌：一般用溶菌酶去壁以形成原生質體或原生質球。③堿變性處理：在SDS等表面活性劑存在下加NaOH液使pH升至12.4，可使菌體蛋白質、染色體DNA以及質粒DNA變性。④質粒復性：加入pH4.8的KAc-HAc緩沖液，將提取液調至中性，由于質粒分子量小而容易復性，并穩定存在于溶液中；染色體DNA分子量太大，在復性過程中形成DNA之間的交聯導致其形成更大分子的不溶性物質。⑤離心分離：經高速離心可以使細胞碎片和已變性的菌體蛋白及染色體DNA一起沉淀3.質粒的特性（1）位于核基因組外，以cccDNA方式存在；（2）有的質粒可整合到核染色體上；（3）可重組（質粒與質粒間，質粒與染色體間）；（4）人為消除（高溫、丫叮類，UV，電離輻射，利福平等）；（5）有的質粒可在細胞間轉移（F因子，R因子）（6）質粒具有不親和性質粒的不親和性（plasmidincompatibility），

有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩定地共存的現象。在細胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質粒稱為不親和質粒。4.質粒的主要類型根據質粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應分類:致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性質粒（Resistancefactor，R因子）產細菌素的質粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質粒（virulenceplasmid）代謝質粒（Metabolicplasmid）隱秘質粒（crypticplasmid）(1)致育因子(Fertilityfactor，F因子)又稱F質粒，其大小約100kb，這是最早發現的一種與大腸桿菌的有性生殖現象（接合作用）有關的質粒。攜帶F質粒的菌株稱為F+菌株（相當于雄性），無F質粒的菌株稱為F-菌株（相當于雌性）。F因子能以游離狀態(F+)和以與染色體相結合的狀態(Hfr)存在于細胞中，所以又稱之為附加體(episome)。在志賀氏菌屬（Shigella）、沙門氏菌屬（Salmonella）和鏈球菌屬（Streptococcus）等其他細菌中也發現了與大腸桿菌類似的致育因子。在放線菌中，天藍色鏈霉菌含有SCP1和SCP2兩種致育質粒，這兩種質粒在天藍色鏈霉菌的接合過程中起重要作用，帶動染色體從供體細胞向受體細胞轉移。(2)抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質粒。R100質粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞（mercuricion，mer）四環素（tetracycline，tet）鏈霉素(Streptomycin,str)、磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸（fusidicacid，fus）負責這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質粒上。抗性質粒在細菌間的傳遞是細菌產生抗藥性的重要原因之一。有的質粒可攜帶多達10種抗生素的基因。抗性質粒可以在關系相近或關系疏遠的菌種間轉移。(3)Col質粒：產細菌素的質粒（Bacteriocinproductionplasmid）細菌素結構基因、涉及細菌素運輸及發揮作用（processing）的蛋白質的基因、賦予宿主對該細菌素具有“免疫力”的相關產物的基因一般都位于質粒或轉座子上，因此，細菌素可以殺死同種但不攜帶該質粒的菌株。細菌素：許多細菌都能產生某些代謝產物，抑制或殺死其他近緣細菌或同種不同菌株，因為這些代謝產物是由質粒編碼的蛋白質，不象抗生素那樣具有很廣的殺菌譜，所以稱為細菌素（bacteriiocin）細菌素種類很多,一般根據產生菌的種類進行命名：大腸桿菌（E.coli）產生的細菌素為colicins（大腸桿菌素），而質粒被稱為Col質粒。此外還有枯草桿菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。由G+細菌產生的細菌素或與細菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質粒基因編碼，有些甚至有商業價值，例如一種乳酸細菌產生的細菌素NisinA能強烈抑制某些G+細菌的生長，而被用于食品工業的保藏。大腸桿菌素產自大腸桿菌的一種蛋白質，具有專一性地殺死其親緣關系很近的、不具Col質粒的其它腸道細菌的功能。(4)毒性質粒（virulenceplasmid）許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質粒引起的，這些質粒具有編碼毒素的基因，其產物對宿主（動物、植物）造成傷害。產毒素大腸桿菌是引起人類和動物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質粒。蘇云金桿菌含有編碼δ內毒素(伴孢晶體中)的質粒根癌土壤桿菌所含Ti質粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子(5)

代謝質粒（Metabolicplasmid）

質粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質的酶，進行共生固氮，或產生抗生素（某些放線菌）等。降解質粒：能將復雜的有機化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，環境保護方面具有重要的意義。如TOL質粒：含分解甲苯的基因；CAM-OCT質粒：含分解樟腦辛烷的基因假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農藥(二氯苯氧基乙酸)、辛烷和樟腦等的能力。根據拷貝數或復制特點，質粒可分為：高拷貝數(highcopynumber)質粒（每個細胞中可以有10~100個拷貝,其復制和染色體的復制不同步）如ColE1、ColE2等

———————松弛型質粒(relaxedplasmid)低拷貝數(lowcopynumber)質粒（每個細胞中只有1~2個拷貝,其復制行為與染色體的復制同步）如F因子，R100

———————嚴謹型質粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細胞中復制）廣宿主范圍質粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細菌中復制）二.轉座因子細胞中能改變自身位置的一段DNA稱為轉座因子。原核生物的轉座因子包括插入序列、轉座子和某些特殊病毒。（一）轉座因子的種類

1.插入序列（insertionsequence）IRTransposaseGeneIR①二個分離的反向末端重復序列

(invertedterminalrepeats,ITR)②一個轉座酶（transposase)編碼基因2.轉座子①復合轉座子——Ⅰ類轉座子由IS類轉座組件構成的復合體。組成：兩端為IS，中間編碼抗生素物質②復雜轉座子——Ⅱ類轉座子（TnA家族）

攜帶轉座和耐藥等基因的獨立體家族。組成：兩端為ITR，而不是IS，中間編碼區含轉座酶編碼基因，及抗生素抗性和解離酶等編碼基因。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座因子的遺傳學效應1.插入突變插到某一基因中，導致該基因突變插到操縱子前半段，引起極性突變插入抗性基因引起抗性突變2.染色體畸變3.基因的移動和重排一.誘發突變

自發突變的頻率是很低的，一般為10－6-10-10。許多化學、物理和生物因子能夠提高其突變頻率，將這些能使突變頻率提高到自發突變水平以上的物理、化學和生物因子稱為誘變劑。

已知的化學致變劑和物理致變劑

物理致變劑

致變劑

電離輻射、紫外輻射等

化學致變劑脫氨劑、烷化劑、

大型加合物供體、堿基類似物、 插入劑、交聯劑。誘變劑導致表型改變——營養缺陷型營養缺陷型：野生型菌株經誘變處理后，由于發生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產物的培養基上生長，這類突變菌株就是營養缺陷型。基本培養基：僅能滿足野生型菌株生長需要的最低成分組合的培養基。完全培養基：可滿足營養缺陷型菌株營養需要的培養基。二.誘變劑與致癌物——Ames試驗埃姆斯實驗1.鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型2.基本培養基3.鼠肝勻漿4.可疑“三致”樣品實驗步驟1.用基本培養基到平板2.將鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型培養液涂在平板上3.將“三致”樣品和鼠肝勻漿混合吸附在濾紙片上，放在平板中央。4.培養2天后看結果。陽性結果陰性結果誘變育種：是用物理或化學的誘變劑使誘變對象內的遺傳物質（DNA）的分子結構發生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種的實踐意義：當前發酵工業和其他微生物生產部門所使用的高產菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產性能的。

1.選擇選擇合適的出發菌株2.制備待處理的菌懸液3.誘變處理4.篩選5.保藏和擴大試驗誘變育種的基本過程出發菌株———用來育種處理的起始菌株

出發菌株應具備：

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產性狀的能力或潛力；

出發菌株的來源；

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經生產考驗的菌株：

③已經歷多次育種處理的菌株。1.出發菌株的選擇要求：

①菌體處于對數生長期

②細胞分散且為單細胞

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學誘變劑——緩沖液

濃度：

細菌、放線菌108個/ml，霉菌、酵母菌106個/ml2.制備細胞懸液選擇合適的誘變劑量：

不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應預先作誘變劑用量對菌體死亡數量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。—致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。最適劑量的選擇：

產量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70～80%）。3.誘變處理選擇誘變劑的種類：在同樣效果下，應選用最方便的因素；在同樣方便的情況下，則應選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，在化學誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發菌株細胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經培養后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落，最后可用影印培養法或逐個檢出法選出突變種。（1）篩選方案：初篩：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優良性狀的菌株不至于漏網；——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應盡可能快速、簡單。復篩：確認符合要求的菌株；——復篩以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.4.菌種篩選①溫度敏感突變株篩選方法：影印法用途：常用于提高代謝物產量原因：是由于某一酶蛋白結構改變后，在高溫下活力喪失（2）突變株篩選舉例由谷氨酸產生菌乳糖發酵短桿菌