第二章色譜法原理

（PrinciplesofChromatography）2-1概述

色譜法早在1903年由俄國植物學家M.Tswett（茨維特）提出，成為十分重要的分離分析手段。實驗：葉綠素分離：石油醚浸提葉片——碳酸鈣填充拄——純凈石油醚淋洗———葉綠素分離（a，b，葉黃素，胡蘿卜素）“色譜”（Chromatography層析法）概念的產生色譜法共同的基本特點色譜法共同的基本特點是具備兩個相：不動的一相，稱為固定相(色譜柱)；另一相是攜帶樣品流過固定相的流動體，稱為流動相（載氣或流動相）。當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相發生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出（洗脫）。與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測。

兩相及兩相的相對運動構成了色譜法的基礎主要色譜儀器及基本工作流程氣相色譜儀：氣路系統、進樣系統、分離系統（色譜柱）、溫控系統（柱溫箱）、檢測系統（檢測器和數據處理系統）組成。液相色譜儀：高壓輸液系統、進樣系統、分離系統和檢測及數據處理系統色譜法分類

2.2.1按兩相狀態分類

氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜（GC），根據固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）．液體為流動相的色譜稱液相色譜（LC）。同理，液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）．超臨界流體為流動相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFC）。其中，在色譜柱制作技術中通過化學反應將固定液鍵合到載體表面，這種化學鍵合固定相的色譜又稱化學鍵合相色譜（CBPC）。

2.2.2按分離機理分類

利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法，稱為凝膠色譜法或排阻色譜法。利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為親和色譜法，常用于蛋白質的分離。固定相裝于柱內的色譜法，稱為柱色譜。

固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。

根據以上所述，將色譜法的分類總結于表2-l中。2.2.3按固定相的外形分類

2-12-2色譜流出曲線及有關色譜術語2.2.1流出曲線和色譜峰

2-1試樣中各組分經色譜柱分離后，以此流出色譜柱，經檢測器轉換為電信號，然后用數據記錄裝置將各組分的濃度變化記錄下來，即得色譜圖。色譜圖是以組分的濃度變化引起的的電信號作為縱坐標，流出時間作為橫坐標的，這種曲線稱為色譜流出曲線。其它色譜術語基線(Baseline)、基線噪聲(Baselinenoise)基線漂移(Baselinedrift)死時間(Deadtime)、死體積(Deadvolume)保留值(Retentionvalue):

Retentiontime&Retentionvolume調整保留值(Adjustedretentionvalue)：Adjustedretentiontime&Adjustedretentionvolume相對保留值(Relativeretentionvalue)區域寬度(Peakwidth)

標準偏差(Standarddeviation)

半峰寬度(Peakwidthathalf-height)

峰底寬度(Peakwidthatpeakbase)

峰高（Peakheight）2.2.2基線

柱中僅有流動相通過時，檢測器響應訊號的記錄值，即圖2-1中O—t線．理想的基線應該是一條水平直線。基線噪聲，基線漂移

2-12.2.3峰高

色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖2-1中B′A

2.2.4保留值（1）死時間tM

不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現峰極大值所需的時間稱為死時間，如圖2-1中O′A′。

因為這種物質不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相的流動速度相近．測定流動相平均線速ū時，可用柱長L與tM的比值計算。

（2）保留時間tR

試樣從進樣開始到柱后出現峰極大點時所經歷的時間，稱為保留時間，如圖2-1O′B．它相應于樣品到達柱末端的檢測器所需的時間．

圖2-1色譜流出曲線（3）調整保留時間tR′

某組份的保留時間扣除死時間后稱為該組份的調整保留時間，即

tR′=tR-tM

由于組份在色譜柱中的保留時間tR包含了組份隨流動相通過柱子所需的時間和組份在固定相中滯留所需的時間，所以tR′實際上是組份在固定相中停留的總時間．保留時間可用時間單位（如s）或距離單位（如cm）表示。保留時間是色譜法定性的基本依據。但同一組份的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積等進行定性檢定。

（4）死體積VM

色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和．當后兩項很小而可忽略不計時，死體積可由死時間與流動相體積流速F0（L／min）計算：

VM=tM·F0

（5）保留體積VR

從進樣開始到被測組份在柱后出現濃度極大點時所通過的流動相體積。保留體積與保留時間t。的關系如下：

VR=tR·F0

（6）調整保留體積VR′

某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調整保留體積，即VR′=VR-VM

（7）相對保留值γ2.1

某組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比，稱為相對保留值：

由于相對保留值只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數據．

必須注意，相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比.*選擇因子

式中tR2′為后出峰的調整保留時間，所以這時α總是大于1的。在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值．在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質對，將它們的相對保留值作為重要參數．在這種特殊情況下，可用符號α表示：2.2.5區域寬度

色譜峰的區域寬度是組份在色譜柱中譜帶擴張的函數，它反映了色譜操作條件的動力學因素。度量色譜峰區域寬度通常有三種方法：

（1）標準偏差σ：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖2-1中EF距離的一半。（2）半峰寬Y1/2：峰高一半處對應的峰寬，如圖2-1中GH間的距離。它與標準偏差σ的關系是：

Y1/2=2.354σ2-1

（3）基線寬度（W或Y）

即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上的截距，如圖2-1中IJ的距離。它與標準偏差的關系是：

Y=4σ

色譜流出曲線可以得到許多重要信息：

（l）根據色譜峰的個數，可以判斷樣品中所含組份的最少個數。（2）根據色譜峰的保留值(位置），可以進行定性分析。（3）根據色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析。（4）色譜峰的保留值及其區域寬度，是評價色譜柱分離效能的依據。（5）色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相和流動相選擇是否合適的依據。

2-3色譜法分析的基本原理

色譜分析根本目的：將樣品中各組分彼此分離，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠.

兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。因此，要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。

2.3.1分配系數K和分配比k（1）分配系數K

色譜分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地分配或吸附--脫附過程（溶解）。分配系數是描述分離過程中樣品分子在兩相間分配的參數，它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值（2）分配比k

分配比又稱容量因子：它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比。k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數。k值也決定于組分及固定相熱力學性質，不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關。

式中CS、Cm分別為組分在固定相和流動相的濃度；Vm為柱中流動相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。分配比k值的計算（直接從色譜圖測得）

滯留因子(保留比)Rs設流動相在柱內的線速度為u，組分在柱內線速度為us，由于固定相對組分有保留作用，所以us＜u．此兩速度之比稱為滯留因子Rs。

對組分和流動相通過長度為L的色譜柱，其所需時間分別為Rs若用質量分數表示，即整理式上述公式，可得

通過色譜流出曲線,就可求得分配比k.2-1（3）分配系數K與分配比k的關系

其中β稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點的又一個參數。例如：填充柱：6～35；毛細管柱：60～600。

分配系數是組分在兩相中的濃度比,分配比是組分在兩相中分配總量之比.熱力學性質(拄溫,柱壓)分配系數只取決與組分和兩相性質,與兩相體積無關,而分配比不僅取決與組分和兩相性質,還與相比有關.一定的色譜體系中,組分分離決定于組分在每相中的相對量,而不是相對濃度,因此,分配比是衡量色譜柱對組分保留能力的重要參數.k越大,保留時間越長,k為0,保留時間為死時間.（4）分配系數K及分配比k與選擇因子α的關系

對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示

上述公式表明：通過選擇因子α把實驗測量值k與熱力學性質的分配系數K直接聯系起來，α對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。兩組分具有不同的分配系數是色譜分離的先決條件。2.3.2塔板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數作為衡量柱效率的指標。

（i）在柱內一小段長度H內，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。（ii）以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。（iii）所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。（iv）分配系數在所有塔板上是常數，與組分在某一塔板上的量無關。理論假定：

為簡單起見，設色譜往由5塊塔板（n＝5，n為柱子的塔板數）組成，并以r表示塔板編號，r=1，2…，n－l；某組分的分配比k=1根據上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下：開始時，若有單位質量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。當一個板體積（lΔV）的載氣以脈動形式進入0號板時，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂到1號板上，此時0號板液相（或固相）中ns部分組分及1號板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0．5，其中氣液（或氣固）兩相各為0．25而1號板上所含總量同樣為0．5．氣液（或氣固）相亦各為0．25。以后每當一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時，上述過程就重復一次(見下表)。

表2-1組分在任一板上的分配情況由塔板理論可建流出曲線方程：m為組分質量，Vr為保留體積，n為理論塔板數。當V=Vr時，C值最大，即由流出曲線方程可推出：

而理論塔板高度（H）即：

從上兩式可以看出，色譜峰Y越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標。通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細管柱n=105--106，H＜0.5mm由于死時tm包括在tr中,而實際的tm不參與柱內分配,所計算的n值盡大,H很小,但與實際柱效能相差甚遠.所以,提出把tm扣除,采用有效理論塔板數neff和有效塔板高Heff評價柱效能。注意:同一色譜柱對不同物質的柱效能是不一樣的,當用這些指標表示柱效能時,必須說明是對什么物質而言.塔板理論基本公式的意義成功之處：塔板理論用熱力學觀點形象地描述了溶質在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導出流出曲線的數學模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數。

局限：由于它的某些基本假設并不完全符合柱內實際發生的分離過程，例如，縱向擴能解釋造成譜帶擴張的原因和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測得不同的理論塔板數，這就限制了它的應用色譜柱n越大,表明組分在色譜柱中達到分配平衡的次數就越多,固定相的作用就越顯著,對分離就越有利!但還不能預言并確定各組分能否被分離(能否分離決定于試樣混合物中在固定相中的分配系數的差異,而不是分配次數差異),因此不能把n有效作為能否實現分離可能的依據,而只能看作是一定條件下柱分離能力發揮程度的標志.本節主要概念和重要公式調整保留時間tR′=保留時間tR-死時間tM

相對保留值γ2.1（選擇因子α）分配系數K與分配比k

與選擇因子α的關系理論塔板數n與保留時間tR和半峰寬Y1/2、峰寬Y的關系理論塔板高度H2.3.3速率理論

1956年荷蘭學者vanDeemter等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學理論——速率理論。吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。

VanDeemter方程的數學簡化式為

式中u為流動相的線速度；A，B，C為常數，分別代表渦流擴散項系數、分子擴散項系數、傳質阻力項系數。(1)渦流擴散項A

在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散，形象地如圖18S1所示。

A＝2λdp上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規則因子λ有關，與流動相的性質、線速度和組分性質無關。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散。因此A＝0。

(2).分子擴散項B/u(縱向擴散項)

縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構型呈“塞子”狀。如圖所示。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發地向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分子擴散項系數為

B＝2γDg式中γ是填充柱內流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況,Dg為組分在流動相中擴散系數（cm2·s-1）。I氣相色譜中影響B項的因素（1）組分保留時間：保留時間長，色譜峰擴張就越顯著（2）載氣性質：載氣分子質量大，Dg小，Dg反比于載氣密度的平方根或載氣相對分子質量的平方根。采用相對分子量較大的載氣（氮氣），可使B項降低，Dg隨柱溫增加而增加，反比于柱壓。（3）彎曲因子γ

γ：填充物的存在造成擴散阻礙而引入的的校正系數。λ：是填充物的不均勻性造成的。II液相色譜的縱向擴散項當試樣分子在色譜柱中被流動相攜帶前進時，由分子本身運動所引起的縱向擴散項同樣引起色譜峰的擴展。它與分子在流動相中的擴散系數Dm成正比，與流動相的線速u成反比。

由于分子在液體中的擴散系數比在氣體中要小4-5個數量級，因此在液相色譜法中當流動相線速度大于0.5cm.s-1。可忽略縱向擴散項的影響。(3)傳質阻力項C·u

由于氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，它們的傳質過程不完全相同.傳質阻力系數C包括氣相傳質阻力系數Cg和液相傳質阻力系數Cl兩項，即C＝Cg＋Cl

I氣液色譜這一過程中試樣組分將在兩相間進行質量交換，即進行濃度分配。有的分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進入兩相界面又來不及返回氣相。使得試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平衡，引起滯后現象，從而使色譜峰變寬。氣相傳質過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程.對于填充柱，氣相傳質阻力系數Cg為

式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質阻力與填充物粒度則的平方成正比、與組分在載氣流中的擴散系數成反比。采用粒度小的填充物相對分子質量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使Cg減小，提高柱效。液相(氣液色譜的固定相)傳質阻力系數Cl為

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴散系數Dl大，則液相傳質阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會使C1增大。當固定液含量一定時，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分離。雖然提高柱溫可增大Dl，但會使k值減小，為了保持適當的Cl值，應控制適宜的柱溫。

將上式總結，即可得氣液色譜速率板高方程

這一方程對選擇色譜分離條件具有實際指導意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對柱效的影響。

傳質阻力系數（C）包含流動相傳質阻力系數（Cm）和固定相傳質系數（Cs），即

C＝Cm＋Cs

II液液分配色譜Cm又包含流動的流動相中的傳質阻力和滯留的流動相中的傳質阻力，即

式中右邊第一項為流動的流動相中的傳質阻力。當流動相流過色譜柱內的填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內流動相的流速是不均勻.ωm是由柱和填充的性質決定的因子。ωsm是常數，它與顆粒微孔中被流動相所占據部分的分數及容量因子有關。

液液色譜中固定相傳質阻力系數（Cs）可用下式表示：上式可見，對固定相的傳質所引起的峰擴展，主要從改善傳質，加快溶質分子在固定相上的解吸過程，著手加以解決。對液液分配色譜法，可使用薄的固定相層，而對吸附、排阻和離子交換色譜，則可使用小的顆粒填料來解決，使用具有擴散系數大的固定液，亦可改善傳質。

該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，主要區別在液液色譜中縱向擴散項可忽略不計，影響柱效的主要因素是傳質阻力項。綜上所述，對液液色譜的VanDeemter方程式可表達為：

（4）流動相線速度u對板高的影響

LC和GC的H－u圖表明，對于一定長度的柱子，柱效越高，理論塔板數越大，板高越小。

但究竟控制怎樣的線速度，才能達到最小板高呢？

根據vanDeemter公式分別作LC和GC的H－u圖由圖a不難看出：LC和GC的H－u圖十分相似，對應某一流速都有一個板高的極小值，這個極小值就是柱效最高點；LC板高極小值比GC的極小值小一個數量級以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多;LC的板高最低點相應流速比起GC的流速亦小一個數量級，說明對于LC，為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。分子擴散項和傳質阻力項對板高的貢獻

（5）固定相粒度大小對板高的影響

固定相粒度對板高的影響是至關重要的。實驗表明不同粒度，H－u曲線也不同（見右圖）：

粒度越細，板高越小，并且受線速度影響亦小。這就是為什么在HPLC中采用細顆粒作固定相的根據。當然，固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術，流動相流速才能符合實驗要求。小結？課后思考：如何利用速率理論公式闡述提高色譜分離效率的方法（H減小）氣液色譜速率板高方程液液色譜速率板高方程2-4色譜分析條件的選擇2.4.1分離度一個混合物能否為色譜柱所分離，取決于固定相與混合物中各組分分子間的相互作用的大小是否有區別。但在色譜分離過程中各種操作因素的選擇是否合適對于實現分離的可能也有很大的影響。因此在色譜分離過程中，不但要根據所分離的對象選擇適當的固定相，使其中各組分有可能被分離，而且還要創造一定的條件，使這種可能性得以實現，并達到最佳的分離效果。圖中（a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。圖中（b）雖然兩峰距離拉開了，但峰形仍很寬，說明選擇性好，但柱效低。圖中（c）分離最理想，說明選擇性好，柱效也高。柱效和選擇性對分離的影響由此可見，單獨用柱效或選擇性不能真實反映組分在色譜柱中分離情況，故需引入一個綜合性指標——分離度R。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱總分離效能指標。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般定義為當R＜1時，兩峰有部分重疊；當R＝1時，分離程度可達98％；當R＝1.5時，分離程度可達99.7％。

通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。

不同分離度時色譜峰分離的程度。例題從色譜圖上測得組分x和y的保留時間分別為10.52min和11.36min,兩峰的峰底寬為0.38min和0.48min,判斷兩峰是否達到完全分離?解：根據色譜分析中分離度（R）定義及計算公式：由于1.95>1.5，故x,y兩組份能分離。

2.4.2色譜分離基本方程

分離度R的定義并沒有反映影響分離度的諸因素。實際上，分離度受柱效（n）、選擇因子(α)和容量因子（k）三個參數的控制。對于難分離物質對，由于它們的分配系數差別小，可合理地假設k1≈k2=k,Y1≈Y2＝Y。由塔板理論公式和上式，得（PP:18）后式即為基本色譜分離方程式

在實際應用中，往往用neff。代替n,處理上式可得

可以看出，后者為基本色譜分離方程式又一表達式。

2.4.3分離操作條件的選擇（1）分離度與柱效的關系

由分離方程式看出，具有一定相對保留值α的物質對，分離度直接和有效塔板數有關，說明有效塔板數能正確地代表柱效能。而分離方程式表明分離度與理論塔板數的關系還受熱力學性質的影響。當固定相確定，被分離物質對的α確定后，分離度將取決于n。這時，對于一定理論板高的柱子，分離度的平方與柱長成正比，即雖說用較長的柱可以提高分離度，但延長了分析時間。因此提高分離度的好方法是制備出一根性能優良的柱子，通過降低板高，以提高分離度。

由基本色譜方程式判斷，當α=1時，R=0，這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。顯然，α大，選擇性好。研究證明，α的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。一般通過改變固定相和流動相的性質和組成或降低柱溫，可有效增大α值。

（2）分離度與選擇因子的關系（3）分離度與容量因子(k)的關系如果設：則分離方程式寫成

由R/Q－k的曲線圖看出：當k＞1O時，隨容量因子增大，分離度的增長是微乎其微的。一般取k為2～10最宜。對于GC，通過提高溫度，可選擇合適的k值，以改進分離度。對于LC，只要改變流動相的組成，就能有效地控制k值。它對LC的分離能起到立竿見影的效果（見圖18d4）。

液相色譜分析通過改變流動相組成改變分離度

（4）分離度與分析時間的關系

下式表示了分析時間與分離度及其他因素的關系。分析時間與分離度呈正相關關系，且為指數關系，分離度越大，所需分析時間越長。（5）基本色譜分離方程式的應用

在實際中，基本色譜分離方程式是很有用的公式，它將柱效、選擇因子、分離度三者的關系聯系起來了，知道其中兩個指標，就可計算出第三個指標。

［例2-1］有一根lm長的柱子，分離組分1和2得到如圖18d5的色譜圖。圖中橫坐標l為記錄筆走紙距離。若欲得到R=1.2的分離度，有效塔板數應為多少？色譜柱要加到多長？解：先求出組分2對組分1的相對保留值r2，1（即α值）求有效塔板數neff

neff＝16×（0.8）2[1.1/(1.1-1)]2＝1239若使R=1.2,所需塔板數可計算,即因此,欲使分離度達到1.2,需有效塔板數為2788塊,則所需柱長為L=2788/1329×1m=2.25m[例2-2]已知某色譜柱的理論塔板數為3600,組分A和B在該柱上的保留時間為27mm和30mm,求兩峰的半峰寬和分離度.

解:∵w1/2=w/1.7w1=27/(3600/16)1/2=1.8mm(w1)1/2＝1.8/1.7＝1.06mmw2=30/(3600/16)1/2=2.0mm(w2)1/2＝2.0/1.7＝1.18mmR＝2(30-27)/(1.8+2)＝6/3.8＝1.6[例2-3]已知物質A和B在一個30.0cm柱上的保留時間分別為16.40和17.63分鐘.不被保留組分通過該柱的時間為1.30分鐘.峰寬為1.11和1.21mm,計算:

(1)

柱分辨本領(R);

(2)

柱的平均塔板數目(n理論);

(3)

塔板高度(H);

(4)

達到1.5分離度所需的柱長度;

(5)在較長柱上把物質B洗脫所需要的時間.

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16(16.40/1.11)2=3493nB=16(17.63/1.21)2=3397nav=(3493+3397)/2=3445=3.44×103(3)H=L/n=30.0/3445=8.708×10-3cm=8.71×10-3cm(4)n2=3445×2.25/1.124=6.90×103

源于n1/n2=(R1/R2)2L=nH=6.90×103×8.71×10-3=60.1cm(5)tr2=tr1(R2/R1)2=17.63×1.52/1.062

=35.3分鐘2-5色譜的定性分析與定量分析

2.5.1色譜定性分析色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。但是不同物質在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專屬的。僅根據保留值對一個完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質、分析目的的基礎上，對樣品組成作初步的判斷，再結合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。（1）用已知純物質對照定性

這是色譜定性分析中最方便，最可靠的方法。這個方法基于在一定操作條件下，各組分的保留時間是一定值的原理。

如果未知樣品較復雜，可采用在未知混合物中加入已知物，通過未知物中哪個峰增大，來確定未知物中成分。純物質對照法定性只適用于組分性質已有所了解，組成比較簡單，且有純物質的未知物。（2）用經驗規律和文獻值進行定性分析

當沒有待測組分的純標準樣時，可用文獻值定性，或用氣相色譜中的經驗規律定性。

①碳數規律大量實驗證明，在一定溫度下，同系物的調整保留時間的對數與分子中碳原子數成線性關系，即式中A1和C1是常數，n為分子中的碳原子數（n≥3）。該式說明，如果知道某一同系物中兩個或更多組分的調整保留值，則可根據上式推知同系物中其它組分的調整保留值。

例：菜籽油或動物脂肪中脂肪酸的測定（甲酯化后）

②沸點規律

同族具有相同碳數碳鏈的異構體化合物，其調整保留時間的對數和它們的沸點呈線性關系，即式中A2和C2均為常數，Tb為組分的沸點（K）。由此可見，根據同族同碳數碳鏈異構體中幾個已知組分的調整保留時間的對數值，可求得同族中具有相同碳數的其他異構體的調整保留時間。例：666，DDT氣相色譜圖（3）根據相對保留值定性有時利用相對保留值定性比用保留值定性更為方便、可靠。在用保留值定性時，必須使兩次分析條件完全一致，有時不易做到。而用相對保留值定性時，只要保持柱溫不變即可。這種方法要求找一個基準物質，通常選容易得到純品的，而且與被分析組分相近的物質作基準物質，如正丁烷、環己烷、正戊烷、苯、對二甲苯、環己醇、環己酮等。（4）根據保留指數定性

保留指數又稱Kováts指數，是一種重現性較其他保留數據都好的定性參數，可根據所用固定相和柱溫直接與文獻值對照，而不需標準樣品。

保留指數也是一種相對保留值，它是把正構烷烴中某兩個組分的調整保留值的對數作為相對的尺度，并假定正構烷烴的保留指數為n100。被測物的保留指數值可用內插法計算。

內插法求IiX示意圖信號tR(Z)

tR(i)

tR(Z+1)

t進樣［例3-4］圖2-19為乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲線（柱溫100℃）。由圖中測得調整保留距離為：乙酸正丁酯310.0mm，正庚烷174.0mm，正辛烷373.4mm，求乙酸正丁酯的保留指數。

即乙酸正丁酯的保留指數為775.6。在與文獻值對照時，一定要重現文獻值的實驗條件，如固定液、柱溫等。而且要用幾個已知組分進行驗證。解：已知n=7（5）雙柱、多柱定性

對于復雜樣品的分析，利用雙柱或多柱法更有效、可靠，使原來一根柱子上可能出現相同保留值的兩種組分，在另一柱上就有可能出現不同的保留值。

（6）與其他方法結合

色譜與質譜、Fourier紅外光譜、發射光譜等儀器聯用是目前解決復雜樣品定性分析最有效工具之一。2.5.2定量分析

色譜定量分析是根據檢測器對溶質產生的響應信號與溶質的量成正比的原理，通過色譜圖上的面積或峰高，計算樣品中溶質的含量。

（1）峰面積測量方法

峰面積是色譜圖提供的基本定量數據，峰面積測量的準確與否直接影響定量結果。對于不同峰形的色譜峰采用不同的測量方法。①對稱形峰面積的測量--峰高乘半峰寬法理論上可以證明，對稱峰的面積

A=1.065×h×W1／2

②不對稱峰面積的測量--峰高乘平均峰寬法對于不對稱峰的測量如仍用峰高乘半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。

A=1/2h（W0.15＋W0.85）

式中W0.15和W0.85分別為峰高0.15倍和0.85倍處的峰寬。③最佳方法--積分法

應用色譜工作站，即計算機及其相關軟件對色譜峰進行積分。積分法自動化，速度快，計算準確，現在的色譜儀幾乎都采用此法。

當色譜峰峰型好的時候，有時也采用峰高來進行定量計算（2）定量校正因子

①

定量校正因子

色譜定量分析是基于峰面積與組分的量成正比關系。但由于同一檢測器對不同物質具有不同的響應值，即對不同物質，檢測器的靈敏度不同，所以兩個相等量的物質得不出相等峰面積。或者說，相同的峰面積并不意味著相等物質的量。因此，在計算時需將面積乘上一個換算系數，使組分的面積轉換成相應物質的量，即

wi=fi′Ai式中Wi為組分i的量，它可以是質量，也可以是摩爾或體積（對氣體）；Ai為峰面積，fi′為換算系數，稱為定量校正因子。它可表示為

fi′=Wi/Ai定量校正因子定義為：單位峰面積的組分的量。檢測器靈敏度Si與定量校正因子有以下關系式