煩惱有何懼怕，既然躲不掉，就調好心態與它共存。心向陽光，何懼風霜。

茫茫人海你我相遇就是緣分，歡迎下載！質粒DNA的小量快速提取22021/4/26

質粒DNA提取是基因克隆中的常規工作，他包括3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增，收集和裂解細菌，分離和純化質粒DNA。本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒DNA的抽提過程。32021/4/26實驗目的掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各主要試劑的作用。42021/4/26實驗原理堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調節其pH值至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。堿裂解法基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。52021/4/26

細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。62021/4/26質粒檢測瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數情況下你能看到三條帶，但千萬不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。72021/4/26質粒DNA的提取方法1.堿裂解法2.煮沸法1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。3、將菌體沉淀懸浮于120mlSTET溶液中,渦旋混勻。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),渦旋振蕩3秒鐘。5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。8、取20ml進行電泳檢查。82021/4/263.酚氯仿裂解法①從瓊脂平板上挑取轉化菌陽性克隆，接種到標準LB培養液中（含有卡那霉素30μg/mL）搖菌12h；收集1.5mL菌液，8000g/min離心3min，棄上清，沉淀加入200μLTE，充分混勻；加入400μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動10s，混勻；12000g/min離心5min，1mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉淀層；上清經國產0.22μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內加入2倍體積無水乙醇，振蕩10s，12000g/min離心5min；沉淀溶于20μL的RTE溶液中，37℃水浴.②按PstI內切酶說明書進行酶切反應（37℃，1h）.酶切產物10μL，10g/L瓊脂糖凝膠電泳.③PCR引物根據參考文獻〔1〕設計，預計擴增產物片斷大小為714bp.④常規制備感受態菌E.coliDH5a，提取質粒DNA常規轉化感受態，涂于含有卡那霉素（30μ/mL）LB培養平板中，37℃培養，15h后觀察篩選克隆情況.92021/4/264.堿變性法5.SDS法6.羥基磷灰石層析法102021/4/261.器材

高壓滅菌器，恒溫搖床，高速離心機，微量可調式移液器，

1.5mL離心管等。2.試劑1、LB液體培養基：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，去離子水950mL，待溶質完全溶解后，用NaOH調pH至7.0，加去離子水至總體積1000mL，121℃，1.01×105Pa高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2.氨芐西林：100mg/mL

實驗試劑和器材112021/4/269、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2月-232月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。17:02:3117:02:3117:022/3/20235:02:31PM11、人總是珍惜為得到。2月-2317:02:3117:02Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。17:02:3117:02:3117:02Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2月-232月-2317:02:3117:02:31February3,202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20235:02:31下午17:02:312月-2315、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。。二月235:02下午2月-2317:02February3,202316、業余生活要有意義，不要越軌。2023/2/317:02:3117:02:3103February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。5:02:31下午5:02下午17:02:312月-23

3.溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L

Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L

EDTA(pH8.0）。配制方法：1M

Tris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5M

EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min，貯存于4℃。4.溶液Ⅱ（新鮮配置）：0.2MNaOH，1%

SDS。配制方法：2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。5.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。配制方法：5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。132021/4/26

6.酚/氯仿：將酚和氯仿等體積混合，用Tris-HCl平衡至pH7.6，至棕色瓶中4℃。

7.TE緩沖液pH(8.0)：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。8.RNaseA(10mg/mL)9.70%乙醇,無水乙醇。142021/4/26實驗步驟1.細菌培養將含有pQE30質粒的大腸埃希菌TG1接種到10mL含有氨芐西林（100μg/mL）的LB培養液中，37℃振搖過夜。2.收集菌體取1.5ml菌液轉入離心管中，10000r/min離心1min，棄上清。3.懸浮細菌將細菌沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液I中，劇烈振蕩使細菌沉淀懸浮。注意：細胞懸液必須懸浮均勻，無可見沉淀塊，否則提取DNA的純度和得率會大大降低。（溶液I的作用是分散細胞，并螯合金屬離子使能夠破壞質粒DNA的DNase失活。152021/4/264.堿液裂解加入新配制的溶液Ⅱ200μl，輕緩顛倒離心管6-8次，使管內容物混均，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置2min。（溶液Ⅱ的作用是使細菌細胞壁破裂釋放內容物，核酸和蛋白質在堿性條件下變性。）

5.中和與復性加入150μl用冰預冷的溶液Ⅲ，輕緩顛倒數次，使溶液III在粘稠的菌液裂解物中分散均勻，在冰浴中放置5min。（溶液Ⅲ的作用是使pH恢復中性，質粒DNA復性，而染色體DNA和蛋白質-SDS復合物形成白色沉淀。）6.離心沉淀用臺式高速離心機12000r/min離心5min,將含有質粒DNA的上清轉入另一離心管中。7.酚/氯仿抽提除蛋白加入等體積的酚-氯仿，劇烈振蕩混勻,靜置3min待其分層后，12000r/min離心10min，將上層液轉入另一離心管中。162021/4/268.乙醇沉淀質粒DNA加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻，靜置5min使質粒DNA形成沉淀。12000r/min離心10min，收集質粒DNA沉淀，棄上清液。9.乙醇洗鹽質粒DNA沉淀里含有一定量的鹽分需出去。加入1ml70％乙醇，輕緩搖動數次，12000r/min離心2min。棄上清液。10.溶解質粒DNA待殘存乙醇揮發干凈后，加30μlTE緩沖液(pH8.0）溶解沉淀，加2μlRnaseA（10mg/L)，37℃保溫30min以去除RNA。所得質粒DNA置-20℃保存備用。172021/4/26注意事項1.提取過程應盡量保持低溫。2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數還是用乙醇。182021/4/26思考題1.溶液I,II,III的作用分別是什么？加溶液I,II,III使要注意哪些問題？2.實驗中加入酚-氯仿、無水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分別是什么？192021/4/269、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2月-232月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。17:02:3117:02:3117:022/3/20235:02:31PM11、人總是珍惜為得到。2月-2317:02:3117:02Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。17:02:3117:02:3117:02Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2月-232月-2317:02:3117:02:31