定量PCR原理及實驗方法方法簡介所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。RT-qPCR是由三個步驟組成：反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;擴增:用PCR的方法擴增cDNA;檢測:實時檢測和定量擴增的產物.RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點(Keyporint):分析結果依賴于模板的數量、質量以及合理的檢測方法設計反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩定性數據分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質量評價以達到最小化變異性，最大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數據分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。存在的問題由于各個學術團體和科研機構使用不同的操作流程，必然導致大家使用不同定量的來源物以及數據分析：新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細胞，組培細胞總RNA或者mRNARNA反轉錄成cDNA的不同的引發策略不同的酶以及酶的不同組合變異系數、靈敏度多類型的檢測化學方法，反應的條件，熱循環儀的分析以及匯報方式。每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理，內參的使用，歸一化的方法，質量控制等等因素嚴重影響RT-qPCR的可信度，重復性。RNA質量評價現在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)比較了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion來定量同樣的樣品。結果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數據。所以用不同的方法進行定量是不明智的。因此，我們需要用統一套定量分析方法來完成所有RNA樣品的評價。RNA質量RNA質量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質和DNA的污染）以及完整性。傳統的RNA質量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流體毛細電泳系統也是一種較新的分析方法。Agilent的2100也是一種十分好的分析RNA質量的方法，它通過分析18S以及28SrRNA的分析圖譜，通過圖譜來反應RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數（RIN）來反應。樣品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA，4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非100%準確定反應mRNA的完整性，因為他們只是反應rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。我們使用oligodT進行逆轉錄，然后對逆轉錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴增產物。探針設計的位點分別位于3’5’以及中部。擴增產物的之間的比值反應RNA的完整性。如果3’5’的比值在1,反應較高度完整性，如果高于5說明降解。QRT-PCR抑制物的組成QRT-PCR抑制物嚴重減少了PCR的靈敏度以及熱動力學反應，高度的抑制還導致假陰性的結果。抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin以及IgG.是否有抑制物的評價體系：通過對目的樣品進行梯度稀釋進行PCR擴增效率的檢測通過內部擴增對照來反應樣品處理過程中樣本的情況用細菌檢測臨床樣品的抑制通過標準人工合成的擴增進行RT-PCR來反應目標檢測物的抑制情況反轉錄反應系統RT和PCR單一酶系統RT和PCR分離的酶系統RNA逆轉錄引物的選擇引物主要有三種：隨機引物：隨機引物，特別是6nt引物對所有的靶位點不產生十分穩定一致的結果，建議使用15nt的隨機引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的樣品，特別有polyA.而且對于一些特殊的變異體以及較長的3’UTR的區域比較困難特異引物：最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR優化PCR優化主要有：引物的濃度建議使用SYBRGreenI和EvaGreen進行擴增和溶解曲線的測試筆者建議的操作流程：靶的選擇和試驗設計針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷查看以下三個網站是否有合適的已經證實的QRT-PCR的擴增引物,探針以及反應條件.RTPrimerDB(http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),PrimerBank(/primerbank/index.html)RealTimePCRPrimerSets()如果沒有合適的或者已經證實的可以提供參考,以下的設計方案僅供參考：最廣泛使用的商業化的軟件BeaconDesigner()DIY的軟件PrimerExpress如果BeaconDesigner無法得到您說需要的結果，或者獲得到設計方案的備選數目不夠的話，可以選擇Sigma-Genosys)的服務方案，詳細周到一個免費的基于網頁構架的引物和探針設計程序：/products/probe_design.asp您可以挑選其中的4-6對引物進行試驗,選擇引物的擴增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網站進行比對,并且用NCBI的ePCR進行虛擬的電子PCR引物設計簡介DNA引物長度:15-25個堿基GC含量:50%左右如果引物的與AT區域富集結合，可以考慮用LNA替換幾個堿基，較少引物的長度以及避免引物次級結構和3’端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭?，分之內雜交，倒轉重復等等會引起引物的引發探針對結合效率達降低，因此我們選擇引物二聚體的AG為負值，即:<10kcal/mol.沒有連續的G/C.引物探針的保存一般遵循以下原則：正向和反向引物保存在-20度，濃度為10mM或者10x工作濃度.探針應該避光保存，貯存在-70度，最好以凍干粉狀態，工作濃度的液體保存一般兩周左右。輸入靶序列，用BLASTn在/blast進行比對檢查比對序列的多態性以及可能的錯誤避免這些區域來進行引物和探針設計在靶序列中避免直接待重復區，在重復區進行雜交容易使得引物非獲得產物性結合，降低DNA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學分析內含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設計跨最長內含子區，這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。在RT步驟時，用(/applications/mfold/rna/form1.cgi)!具檢測在特定溫度下靶序列的折疊情況，避免一些高度次級結構的區域，那些區域探針和引物結合效率較低盡可能用60-150bp的擴增產物，GC含量在60%或者稍小來確定高效的變性，更高度反應效率。GC含量高度序列容易產生非特異性的反應，短序列擴增是的擴增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴增多標準曲線。用oligodT進行逆轉錄最好設計擴增子位于靠近模板的3’區域量PCR除可以對樣品的初始濃度進行準確定量外，還有其它多種豐富的應用。還包括基因表達調控情況的分析、等位基因的分析等，那么這些功能是如何在一臺定量PCR儀上實現的呢？下面將進行一一介紹。利用標準曲線對樣品的初始濃度進行定量：用已知濃度的標準品繪制標準曲線來對未知樣品定量，首先要有一組穩定的標準品。標準品可以是含有目的基因的線性化的質粒DNA，也可以是比擴增片段長的純化后的PCR產物，當然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作為標準品的核酸都必需保證穩定。一般一條標準曲線取四到五個點，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區間，以保證定量的準確性。一般一個點重復三至五次，對于常期穩定使用的標準品可以適當減少重復的次數。以Rotor-Gene3000的操作為例，以標準曲線對未知樣品定量是默認的分析方法。軟件可在反應尚在進行時就對結果進行分析，結果隨著反應的進行可實時更新，當然也可以等反應完全結束后再進行分析。點示“Analysis”，彈出分析框，默認分析功能即為“Quantitation”，點擊“Show”，軟件即自動給出包括標準曲線（包括R值，R平方值，擴增效率、標準曲線公式等）、標準化的熒光曲線、各樣品計算濃度（包括標準偏差、變異系數等）在內的結果。若是使用SYBRGreenI法，還可進行熔解曲線分析，以判斷退火溫度是否合適，產物中是否有引物二聚體的影響。對于SYBRGreenI的客戶，我們建議一定要在最后做一步熔解曲線的分析，這對于反應條件的優化和結果的正確判定都有著非常重要的作用。同樣，點擊“Analysis”，在分析窗口中選擇“Melt”，點擊“Show”，自動給出分析結果。完成了所需的分析之后，如還需給出分析結果報告，點擊“Analysis”邊上的“Report”選項，選擇報告模板，軟件自動給出報告。利用定量技術進行基因型分析研究：常用的分析方法有兩種，一種是Taqman探針法，一種為FRET探針法（又稱Hyb探針），運用以上兩種方法進行基因型的分析需要一臺有多通道的熒光定量PCR儀。Taqman探針分析基因型是以擴增信號的有無來判定，而FRET探針則根據擴增后片段熔解溫度的不同來判定。以下為用Taqman探針判斷基因型的實例：這里，突變型的探針以FAM熒光素標記，野生型的探針以VIC熒光素標記，檢測時分別同時檢測了FAM通道和VIC通道的熒光情況。這里，3、4號樣品只在FAM通道有信號，而在VIC通道里無信號，表明這兩個樣品為突變型；1、2號樣品在FAM通道無信號，在VIC通道有信號，表明這兩個樣品為野生型；而5、6號樣品在兩個通道都有信號，但熒光強度恰為其它樣品的一半，說明這兩個樣品為雜合型。并且，我們可以在軟件里將不同的通道定義為不同的基因型，軟件會根據不同樣品在各個通道的熒光情況，自動對各個樣品的基因型做出判定。以下為用FRET方法分析基因型的實例：如上圖，熒光探針與突變型完全匹配，而與野生型存在一個堿基的錯配，因而打開這兩組雙鏈所需的能量就不同，具體體現在熔解溫度的差異上，因而突變型的樣本有較高的熔解溫度，而野生型的樣品熔解溫度相對較低。在圖中，5號樣本熔解溫度較低，為野生型；2號樣本熔解溫度較高，為突變型；而1、3、4號樣品在高溫和低溫處都出現了熔解峰，則它們為雜合型。并且用戶還可以將不同的峰定義為不同的基因型，軟件可根據用戶的定義自動給出未知樣品的基因型。如上圖表格中所示。利用相對定量的方法分析目的基因的上下調情況：基因表達調控研究中，常用的相對定量方法主要有兩種，Delta-deltaCt法和雙標準曲線法。由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。我們分別來看看以上兩種相對定量分析方法的特點和應用。Delta-deltaCt：公式：由Delta-deltaCt的公式可以看出，該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認兩個基因擴增效率一致。ComparativeDelta-deltaCt法的特點、注意事項及實際應用：ComparativeDelta-deltaCt法的一大特點是，當優化的體系已經建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。每次實驗都默認目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優化，并且總會存一定的偏差。用ComparativeDelta-deltaCt法展開定量實驗前，在預實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。Rotor-Gene的軟件會自動給出兩組標準曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續實驗中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法進行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。下面是某科研用戶用Delta-deltaCt進行相對定量分析的實例：首先，該客戶分別做了目的基因和看家基因的確標準曲線，根據軟件自動給出的M值判斷該方法的可行性：如下圖，將標準品進行梯度稀釋后，分別對目的基因(GeneofInterest)和看家基因(HousekeeperGene)做標準曲線。軟件自動繪制標準曲線，并給出相應的參數。從上圖可知，兩組標準曲線的M值分別為-3.525和-3.467，兩者的差值＜0.1，因此，這組看家基因和目的基因可以用ComparativeDelta-deltaCt法進行相對定量。確定這兩個基因可以用Delta-deltaCt法分析后，用戶擴增了其待測樣品的目的基因和看家基因。經軟件自動分析后，給出分析結果，如下：我們看到，在該客戶的實驗中，以樣品A為對照組，軟件自動組出了樣品B和C的目的基因相對于樣品A的表達情況。這種方法對于樣品量大，但研究的基因數目相對較少的客戶特別有用，因為一旦條件優化好之后就無需再做標準曲線，節約了試劑和樣品量，實驗操作也相對簡單。雙標準曲線法：雙標準曲線法考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效率。雙標準曲線法的特點、注意事項及實際應用：雙標準曲線法做相對定量分析的最大特點是，應用簡便，無需像Delta-deltaCT法那樣對實驗進行嚴格的優化。其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。并且，如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品，比如標準品為質粒或純化的PCR產物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以