ICS65.120B20中華人民共和國國家標準GB/T20190—2006飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應(PCR)法Detectionofbovine：sheepandgoat-derivedmaterialinfeeds-Qualitativepolymerasechainreaction（PCR)method2006-05-17發布2006-09-01實施中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局愛布中國國家標準化管理委員會

GB/T20190—2006前本標準的附錄A為規范性附錄本標準由全國飼料工業標準化技術委員會提出本標準起草單位：國家飼料質量監督檢驗中心(北京)、中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所。本標準主要起草人：楊曙明、宋榮、程憲國、高生、賴衛華、王彤。

GB/T20190—2006含牛羊源性成分的動物源性飼料的使用，-直被認為是瘋牛病傳播的主要途徑.禁止疫區含牛羊源性成分的動物源性飼料的生產、流通和使用.成為預防瘋牛病感染、流行的主要手段之一。1996年歐盟提出了動物源性飼料中牛羊源性成分的檢測方法（EUR18096EN)。2002年我國發布了中國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T1119—2002《進出口動物源性飼料中牛羊源性成分檢測方法PCR法》用于檢測動物源性飼料。我國沒有針對配合飼料和濃縮飼料等飼料產品中牛羊源性成分的檢測標準.EUR18096EN和SN/T1119—2002方法適用于動物源性飼料.在DNA提取上不適用于以植物為主要基質的配合飼料和濃縮飼料。本方法是在SN/T1119—2002、歐盟方法的基礎上提出.在大量實驗數據基礎上建立起來的。

GB/T20190—2006飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應(PCR)法1范圍本標準規定了PCR方法對飼料中牛羊源性成分定性檢測本標準適用于飼料中牛羊源性成分的定性檢測.本方法的最低檢出限為0.25%2規范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勒誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而.鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法原理根據牛羊遺傳物質的特異性，通過檢索基因庫或專利庫,選擇牛羊特異性的DNA序列，該序列必須在同類動物(無論什么品種)中都具有高度保守性，而其他動物皆不含有。利用種屬特異性的引物通過PCR擴增這一特定的DNA序列,通過電泳分離PCR產物,以標準長度的PCR產物作對照,檢測PCR擴增出的這一特定的DNA片斷.判斷是否含有牛羊源性成分。此外.通過限制性內切酶酶切反應.進一步判斷結果。通過對PCR擴增的特定DNA片斷進行測序,與標準序列進行比較,來確認檢測結果。試劑與材料除非另有說明,在分析中僅使用分析純試劑,水應符合GB/T6682一級水要求.4.1三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCI)溶液,1mol/L.pH值為8.0:在800mL.去離子水中洛解121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris).冷卻至室溫后用濃鹽酸調節溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓火菌。4.2三羥甲基氨基甲燒鹽酸（Tris-HCI)溶液,1mol/L.pH值為7.5:在80mL去離子水中溶解12.11gTris.冷卻至室溫后用濃鹽酸調節溶液的pH值至7.5,加水定容至100mL.分裝后高壓滅菌。4.3氯化鈉溶液,5mol/L:在80mL水中溶解29.22g氯化鈉.加水定容至100mL..4.4乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)溶液，500mmol/L:稱取186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa.·2H.O).加入700mL水中,在磁力攪拌器上劇烈攪拌,用10mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至8.0,用水定容到1L，分裝后高壓滅菌。4.5溴代十六烷基三甲胺(CTAB)提取緩沖液I：在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉.搖動容器使溶質完全溶解,然后加人50mLTris-HCl溶液(4.1)和20mLEDTA溶液(4.4）,然后定容至1L.分裝后高壓滅菌。4.6溴代十六烷基三甲胺(CTAB)提取緩沖液Ⅱ：在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉.20g溴代十六烷基三甲胺(CTAB)搖動容器使溶質完全溶解.然后加入50mLTris-H