ICS11.220B41中華人民共和國國家標準GB/T19439—2004H5亞型禽流感病毒NASBA檢測方法ProtocolofdetectingavianinfiuenzavirussubtypeH5usingNASBA2004-02-14發(fā)布2004-02-15實施中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布中國國家標準化管理委員會

GB/T19439-2004前高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒屬中A型流感病毒引起,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疾病，我國將其列為一類動物疫病依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)檢測禽流感病毒的敏感性與經(jīng)典的雞胚病原分離方法相當.并具有檢測速度快、特異性強、與雞旺病原分離方法符合率高、易于操作的特點。本標準是在綜合我國科研成果的基礎上,參考OIE《診斷試驗和疫苗標準手冊》(2000年版)并結合我國現(xiàn)有動物衛(wèi)生法規(guī)及農(nóng)業(yè)部對禽流感的相關政策和措施制定的。本標準附錄A、附錄B、附錄C為規(guī)范性附錄，附錄D為資料性附錄本標準由上海市質(zhì)量技術監(jiān)督局和中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局提出。本標準由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局歸口。本標準起草單位：中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局、上海市質(zhì)量技術監(jiān)督局、香港基因品片開發(fā)有限公司。本標準起草人：單松華、陳家華、謝燕、楊錫全、倪旦紅、劉樂庭、劉俊平。

GB/T19439—2004H5亞型禽流感病毒NASBA檢測方法范圍本標準規(guī)定了NASBA快速檢測H5亞型禽流感病毒技術規(guī)范的材料準備、操作方法和結果判定本標準適用于禽類、禽肉產(chǎn)品中H5亞型禽流感病毒的快速檢測、診斷，規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件.其隨后所有的修改單(不包括勒誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準.然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。GB/T18936—2003高致病性禽流感診斷技術原理NASBA（Nueleicacidsequence-basedamplification·NASBA·依賴核酸序列的擴增技術）是一項連續(xù)、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術。該技術使用三種酶(反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、喔菌體T7核糖核酸聚合酶)和兩條寡核苷酸引物。上游引物5'末端含有喔菌體T7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子序列，下游引物的5°末端含有和釘標電化學發(fā)光檢測探針互補的序列。在擴增步驃中.兩個5端都整合進擴增序列中.這樣既成為產(chǎn)生互補RNA序列的模板.又能特異性結合檢測步驃中的ECL探針。擴增底物與ECL探針形成復合物，攜帶該復合物的磁珠被電極的表面磁性捕獲。電極上的電壓引起電化學發(fā)光（ECL)反應。已雜交上的釘標磁珠發(fā)出的光和擴增反應產(chǎn)生的RNA擴增產(chǎn)物總量成比例對應。材料準備武驗環(huán)境干凈的環(huán)境,最好分區(qū)。分為核酸提取、核酸擴增和核酸檢測三個區(qū)4.2器材采用常規(guī)的分子生物學器材，包括：一次性手套、移液器(量程5L到200L）、槍頭、無RNA酶的1.5mL塑料離心管、1.5mL離心管架、5mL試管架、旋渦振蕩器、計時器、高速臺式離心機、溫度計(精度士2C)、加熱器、水浴鍋、5mL聚丙烯試管(VWR)、封口膜等。如果采用ECL方法，需要NucliSens閱讀器或者等同的儀器如果采用ELISA方法·需要酶標儀4.3物上游引物AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAIAAAGA（C/T)AGACCAGCTAF游引物GATGCAAGGTCGCATATGAGGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC4.4檢測試劑所有檢測試劑在使用前，使其達到室溫裂解緩沖液：5mol/L異硫氰酸服.10%TritonX-100,10mmol/LTris